类风湿性关节炎(RA)是以关节滑膜慢性炎症为主的系统性自身免疫疾病，其主要特征是在关节处大量释放TNFα，IL-1及IL-6等炎症细胞因子，最终导致关节的结构破坏和功能障碍。在这些炎症细胞因子中，TNFα是RA滑膜炎发生最为重要的细胞因子，其水平反应临床关节炎的严重程度。TNFα主要由单核细胞、巨噬细胞以及部分T细胞产生，其在RA发病中的主要作用是诱导机体产生其它炎症细胞因子，如IL-1β和IL-6等，加剧炎症反应。同时，它还可以诱导单核细胞及巨噬细胞产生并释放趋化因子，招募淋巴细胞从血管中转移到炎症部位。TNFα的过表达可以诱导巨噬细胞和成纤维细胞分泌蛋白水解酶以及金属蛋白酶，导致关节处的关节软骨和软骨下骨的组织破坏，并引起破骨细胞的重吸收。　　由于TNFα在类风湿性关节炎中的重要作用，因此研发以TNFα为靶点的治疗性抗体以阻断TNFα发挥生物学效应成为目前RA治疗的新策略，现已经在中国上市的TNFα治疗性抗体有Adalimumab（阿达木单抗）、Etanercept(恩利)、Infliximab（英夫利昔）等。临床研究结果显示用于临床治疗的TNFα特异性生物制剂在改善RA病人的临床症状以及降低病人的组织损伤方面表现出良好的疗效，在某些情况下与常规的非生物制剂如MTX联合使用的临床效果更佳。但是，随着临床研究和临床应用数量的增加，发现这些TNFα特异性生物制剂在临床使用中呈现患者感染风险增大的现象，如阿达木单抗或英夫利昔在RA病人中引起的严重感染的风险比常规治疗高出一倍，其中结核分枝杆菌感染导致的结核病是最主要的感染性疾病，英夫利昔治疗组病人感染结核分枝杆菌后的发病几率是对照组的4倍；英夫利昔联合MTX治疗组的RA病人患肺炎的几率显著高于单独使用MTX治疗组病人；此外，蜂窝组织炎和败血症也是TNFα抑制剂在治疗RA病人中常见的副作用。上述这些临床应用现象强烈提示TNFα在抗感染中具有重要作用。　　记忆性T细胞（TM）是机体免疫系统参与免疫保护的主要细胞，特别是在机体再次受到侵害时它们可以快速启动强有力而持续的免疫保护作用，TM的维持、功能发挥及分布受到诸多因素的影响，其中包括炎性细胞因子。根据TM细胞的归巢、增殖能力以及免疫功能的不同，可以将TM进一步划分为中枢型记忆性T细胞（TCM）和效应型记忆性T细胞（TEM）。TCM细胞可以表达淋巴细胞归巢受体CCR7，主要分布于二级淋巴器官；TEM不表达淋巴细胞归巢受体CCR7，主要存在于血液、淋巴器官及组织中，可以快速分泌大量效应细胞因子，具有很强的免疫监视功能。RA病理状态下TM的稳态和分化发生功能性紊乱。例如，在未治疗的早期RA病人中，CD4+TM细胞分泌效应细胞因子的能力下降，同时外周循环中CD4+和CD8+TM细胞比例与RA临床的病理因子IgM-RF的水平呈现正相关性，而后者是RA疾病严重程度的一个重要指标。然而，目前对于TNFα抑制剂治疗RA患者后对TM细胞的影响作用尚不清楚。　　本研究的第一部分利用抗TNFα抑制剂的临床试验，比较分析Etanercept和Golimumab（GM）临床应用后对RA患者细胞免疫记忆功能的影响。Etanercept于1998年作为第一种TNFα阻断剂获批应用于RA的临床治疗，诸多临床研究结果显示Etanercept可以影响多种细胞因子、趋化因子以及蛋白酶的产生，调节RA的炎性发展过程；Etanercept和MTX联合治疗改变Th1/Th2的失衡，显著降低Th17的细胞数量，明显增加Treg的细胞数。Golimumab于2014年由美国FDA批准上市用于治疗成人类风湿性关节炎，GM是特异性针对可溶性及跨膜形式TNFα的高亲和力人源化单克隆抗体，可以通过阻断TNFα与其受体的结合发挥中和活性。在对MTX不敏感的RA病人中联合应用GM与MTX时，可以显著改善疾病的病症，并且无免疫副反应发生。利用上述两个TNFα抑制剂的临床试验，我们分析了TNFα抑制剂治疗RA病人组（RA-ETA和RA-GM），非生物制剂治疗RA病人组（RA-NB）以及健康人（HC）记忆性Τ细胞表型和功能的影响。同时，在RA-GM组中我们还分析其对抗原特异性T细胞应答的影响。　　我们的研究结果显示，与HC组相比，RA-NB组患者外周CD8+TCM细胞比例显著增加，而CD8+TEM细胞比例则有所减少。两种TNFα抑制剂治疗患者外周记忆性T细胞的格局并不相同，其中RA-ETA治疗组的RA患者外周记忆性T细胞与RA-NB组相比并没有变化；但是经GM治疗过的RA-GM组患者外周 TM细胞却表现出和RA-NB组患者完全相反的分布格局，其中CD8+TCM细胞在外周中的比例在GM治疗组（2.41±1.08%）中显著低于RA-NB组（22.86±13.99%）和HC组（12.12±11.65%）（p值均小于0.0001)；CD8+TE细胞在外周中的比例在RA-GM治疗组(42.38±11.11%)中显著高于RA-NB组（23.08±17.47%）（p=0.0005）；CD8+TEM细胞比例在RA-GM治疗组(39.34±13.34%)中显著高于RA-NB组（23.33±16.20%）和HC组（24.90±16.09%）（p值分别为0.002和0.009）。进一步分析记忆性CD4+T细胞中亚群的比例，同样在RA-GM组中显示出TCM向TEM的转换，RA-GM组中TEM(49.94±25.08%)的比例显著高于RA-NB组(32.76±15.83%，p=0.03)和HC组(24.87±12.97%,p=0.001)，而TCM的比例在RA-GM组(6.79±6.61%)则是显著低于RA-NB组(31.46±11.32%,p<0.0001)和HC组(34.10±15.03%，p<0.0001)。上述结果显示了GM治疗后的记忆性 T细胞分布格局的动态变化。临床指标的相关性分析结果显示，RA-NB患者体内CD8+TCM细胞比例和RA疾病活动性的评价指标ESR值（Erythrocyte Sedimentation Rate）呈正相关，而其CD8+TE细胞比例和ESR值呈负相关趋势。GM治疗的RA患者中，其炎性、疾病活动性的最新临床指标也有上述相关趋势。　　我们进一步分析不同治疗组外周TM细胞中IFNγ,TNFα,IL-2和IL-17细胞因子的分泌水平，从而进一步获得不同TNFα抑制剂对记忆性T细胞功能影响的证据。将不同治疗组患者和HCs的PBMCs体外用PMA/Iono刺激之后检测产生上述四种细胞因子的细胞比例。结果显示，RA-NB病人来源的PBMCs中CD8+TM和CD4+TM细胞因子的表达水平相对于HC来源的PBMCs没有变化。RA-ETA治疗组患者外周IFNγ+CD4+TM细胞比例（17.76±18.13%）显著低于HC组（23.9±17.59%）（p=0.04)；同时，其IL-2+CD4+TM细胞比例（21.11±18.33%）显著低于RA-NB组(35.96±21.82%)（p=0.04）。此外，RA-ETA治疗组来源的PBMC中IFNγ+CD8+TM细胞的比例低于RA-NB组(41.87±23.78%vs58.41±25.49%,p=0.04)。上述结果表明Etanercept治疗后，患者外周CD4+TM和CD8+TM细胞分泌细胞因子的能力呈现下降的趋势。分析RA-GM治疗组中TM细胞分泌细胞因子的水平结果显示，其TNFα+CD4+TM细胞的比例（65.24±8.32%)显著高于RA-NB组（37.37±26.84%,p=0.0002）和HC组（36.63±25.08%,p<0.0001），而IL-17+CD4+TM细胞比例则是高于HC来源的PBMCs中的比例(1.93±1.00% vs1.29±1.21%，p=0.06);在CD8+TM中，RA-GM组TNFα+CD8+TM细胞的比例（77.62±9.44%)同时高于RA-NB组（41.51±24.84%,p<0.0001）和HC组（41.14±28.14%,p<0.0001）；RA-GM组IL-2+CD8+TM细胞比例（45.25±16.02%）也显著高于RA-NB组（22.23±16.72%,p<0.0001）和HC组（19.86±14.91%,p<0.0001）；RA-GM组IL-17+CD8+TM细胞比例（1.76±1.83%),高于RA-NB组（0.62±1.03%,p=0.0005）和HC组（(0.28±0.61%,p<0.0001)；但是RA-GM组外周IFNγ+CD8+TM细胞比例相对于RA-NB和HC组来源的PBMC没有变化。上述结果显示与RA-NB组和HC组相比，RA-GM组的RA患者外周PBMCs经体外刺激后TM细胞分泌多种细胞因子的能力显著提升。　　上述这些临床研究结果的意义何在呢？事实上前期研究结果表明TNFα对Τ细胞的功能具有一定的抑制作用，阻断TNFα可以导致Τ细胞分泌IL-2,TNFα和IFNγ的能力有所升高。但是对免疫记忆细胞功能的调节如何还尚未见报道。在本研究中，Etanercept治疗后RA患者记忆性T细胞分泌部分细胞因子的能力呈现下降的表型，和已有报道的TNFα的抑制功能相反；但是在GM治疗后则呈现出和Etanercept不同的应答格局，其中GM治疗组中CD4+TM和CD8+TM细胞分泌IFNγ的能力未见显著变化，而分泌TNFα的CD8+TM和CD4+TM细胞比例显著增加，这也是我们在本研究中观察到的记忆性T细胞分泌细胞因子功能中最显著的变化。其意义可能与TNFα参与调节IL-15和IL-7有关，因为已有研究表明高水平的TNFα与RA患者滑膜和血浆中IL-15和IL-7的水平呈正相关，而TNFα抑制剂治疗可以显著减少这两种细胞因子在外周的水平。由于IL-15和IL-7在记忆性T细胞的生存、分化和维持中有重要的作用，所以GM治疗组中CD4+TM和CD8+TM细胞分泌TNFα水平的增加可能体现了反馈机制，通过反馈性的增加TNFα的产生，影响IL-15和IL-7的表达，从而使GM治疗组的记忆性T细胞亚群维持在正常水平。　　根据已有的临床研究结果表明TNFα抑制剂使用后患者的感染比例有所上升，那么是否有免疫学的手段加以分析其中的机制呢?为此，我们进一步分析了不同治疗组中针对病毒抗原的特异性T细胞的功能。利用CMV-EBV-FLU(CEF)抗原肽刺激PBMCs后，通过检测抗原特异性IFNγ+CD8+T的比例，我们比较分析了TNFα抑制剂对抗原特异性T细胞的功能影响。结果显示不同组别中产生抗原特异性应答的比例并不相同，HC组中39.5%的个体产生特异性应答，RA-NB组中的比例是30.03%,RA-ETA组的应答比例是25%，这三组比例基本相当，但是RA-GM组对CEF肽段的应答比例达到66.7%，明显高于其他三组；同时，与RA-NB组以及HC组相比，用FLU肽段刺激后，RA-GM组的HLA-A2+RA患者体内分泌IFNγ的抗原特异性CD8+TM细胞比例（0.66±1.03%）显著高多于RA-NB组（0.09±0.15%)和HC组（0.08±0.09%），p值分别为0.003和0.001。上述结果表明，和非特异性细胞因子分泌结果一致，RA-GM组个体针对抗原特异性的CD8+T细胞的应答能力和比例水平也有所提高。　　临床研究结果显示RA患者感染流感的几率显著高于健康人群；而生物制剂的应用会增加结核病和流感等的感染风险。由于TM细胞在抗感染免疫再次应答中起着重要的作用，综合外周免疫记忆T细胞的分布和功能研究结果，提示GM作为一种新的TNFα抑制剂，在治疗类风关过程中可能发挥增强特异性免疫应答的作用，同时也提示不同的TNFα抑制剂在临床上的使用对于记忆性细胞的免疫调节作用不尽相同，目前虽然还没有head-to-head的大规模队列研究比较，但是不同TNFα抑制剂使用后临床观察到的感染率的差异或许可以支持我们的观点，如Infliximab治疗RA患者结核分枝杆菌的感染率为7.5%，而用Etanercept和Golimumab治疗的患者其感染率则较低，分别仅为0.1%和0.8%。提示GM治疗后抗原特异性T细胞应答功能的增强可能与其在临床上所观察到的低感染率之间存在一定的相关性。　　为了进一步探讨上述临床研究中观察到的TNFα抑制剂对记忆性T细胞功能影响的作用机制，我们在第二部分研究中通过建立CIA小鼠关节炎模型，经TNFα抑制剂进行治疗后，分析小鼠脾脏和外周血中CD4+T和CD8+T细胞的分布格局和功能变化。结果显示治疗组小鼠脾脏中CD4+和CD8+效应性T细胞比例明显增多，然而TM细胞分泌IFNγ和TNFα的能力降低。此外，我们用结核分枝杆菌优势抗原ESAT-6免疫关节炎病理模型小鼠和健康小鼠，4周后检测抗原特异性T细胞的功能，结果显示与健康组小鼠相比，关节炎小鼠脾脏中ESAT-6特异性IFNγ产生细胞的数量明显减少；与未治疗的关节炎小鼠相比，用TNFα抑制剂治疗后小鼠脾脏ESAT-6特异性的IFNγ产生T细胞比例有所增加。然而，其他细胞亚群在治疗组和未治疗关节炎小鼠中均呈减少趋势。我们还同时检测了与免疫记忆细胞存活和功能相关的转录因子，包括:bcl-6,c-myc,eomesodermin,nf-kb和t-bet。结果显示eomes在未治疗CIA组（0.56±0.18）的表达水平相对于正常小鼠组（1.04±0.33）表达下调（P=0.02）；而CIA治疗组（0.85±0.18）中eomes的表达水平高于未治疗组（0.56±0.18)。因此，在不同的处理组之间eomes基因表达水平的变化与抗原特异性细胞比例的变化规律相一致。NF-KB和Bcl-6基因表达水平在CIA未治疗组和治疗组与正常小鼠相比都有下调趋势。但是，c-Myc和T-bet基因表达水平在不同处理组之间没有差别。因此，TNFα抑制剂治疗类风湿性关节炎的过程中，可能通过改变免疫记忆细胞的转录功能从而影响记忆性T细胞的功能。　　综合临床研究和实验动物模型的研究结果，表明抗TNFα抑制剂治疗RA的过程中，免疫记忆性T细胞的动态平衡和功能发生变化。本研究的临床研究结果显示，不同TNFα抑制剂对TM细胞亚群的调节作用不尽相同，提示这些抑制剂发挥生物学功效的差异性。就重点关注的TNFα抑制剂Golimumab在临床使用后，主要表现为对TCM和TEM的比例的影响，而对未致敏和效应T细胞的影响很小；同时其对TM分泌细胞因子的功能也有影响。我们认为不同TNFα抑制剂在临床上对免疫功能调节的差异性与其临床症状的改变相关联。同时更重要的不同TNFα抑制剂的使用在临床表现出的对病原菌的易感性的差异可能和它们对免疫功能不同的调节作用有关，从而成为这些抑制剂在临床上推广应用的主要选择依据之一，而通过精确分析TNFα对抗原特异性T细胞功能的影响，获得可以预测感染发生的免疫学标志物将会为这些抑制剂在临床更精准的应用提供依据。不同TNFα抑制剂对记忆性T细胞的免疫功能和动态平衡点调节机制将有待于进一步深入研究。