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目的:提取、分离、培养大量高纯度并且能够稳定传代的新西兰兔脂肪干细胞;建立新西兰兔单侧输尿管连接部位梗阻肾积水模型;脂肪干细胞对新西兰兔肾积水病肾损害的保护作用和相关机制探讨。方法:1.提取、分离、培养大量高纯度并且能够稳定传代的新西兰兔脂肪干细胞:选择3月兔龄的新西兰兔作为脂肪来源,动物麻醉后从其颈背部后方正中切口提取脂肪;采用含1%青链霉素双抗的PBS缓冲液进行反复冲洗、悬浮,并使用Ⅰ型胶原酶在37℃进行消化30min;消化完成后离心、重新悬浮,调整细胞浓度为1×105mL,接种于25mL的细胞培养瓶中,置于37℃、5%的CO2恒温培养箱进行培养。采用倒置显微镜对细胞的生长情况进行观察,在经过约1周时间的原代培养后,按照1:3的比例进行传代培养。当ADSCs传代至第二、三代时,挑选生长良好的细胞进行冻存。选择培养至P4代的细胞采用流式细胞仪进行细胞表型鉴定。2.建立新西兰兔单侧输尿管连接部位梗阻肾积水模型:24只新西兰兔分为正常对照组和肾积水模型组,每组12只。麻醉后对动物进行固定,沿兔正中线将兔腹腔开切,打开腹腔,分离出兔左侧肾脏,在肾脏下方1.5cm处游离出输尿管,并使用塑料套管套在左侧的肾盂输尿管连接处,用1-0丝线结扎,缝合肌肉筋膜,关闭腹腔;对照组进行假手术。使用多普勒超声观察术后1周、2周、3周、4周模型组兔肾脏的肾积水情况,并与正常对照组进行比较;每周各抽取2只兔进行肾脏切片组织病理学观察,剩余4只进行梗阻解除。采用多普勒超声观察动物肾脏的形态变化和积水情况,测量肾脏皮质厚度（RCT）、肾盂的前后径（APD）、长径、宽径,观察形态变化,同时对麻醉后的动物进行肾门处动脉、肾内段动脉和叶间动脉的收缩期峰值血流速度和动脉血流阻力指数进行测定来判定动物肾脏功能;采用静脉尿路造影观察肾脏形态变化;肉眼对大体解剖后的肾脏进行观察,并采用光学显微镜观察HE染色后的肾脏组织切片。3.脂肪干细胞对新西兰兔肾积水病肾损害的保护作用和相关机制探讨:36只SPF级新西兰兔随机分为三组,分别是假手术组、肾积水模型组和治疗组,每组12只。对照组进行假手术,第4周时进行肾动脉PBS缓冲液注射;模型组和治疗组建立单侧UPJO肾积水模型,并于建立模型后第4周解除梗阻,模型组解除梗阻后进行PBS缓冲液动脉注射,治疗组解除梗阻后进行脂肪干细胞动脉注射移植。于梗阻0周、梗阻4周、解除梗阻4周时测定假手术组、模型组和治疗组的新西兰兔的血清肌酐、血清尿素氮浓度衡量其肾脏功能。于梗阻解除4周后对动物进行麻醉,收集各组动物的肾盂尿液,摘取左侧肾脏,肉眼观察三组动物的肾脏形态;对肾脏组织切片进行HE染色,采用光学显微镜进行观察;肾脏组织切片进行3%醋酸铀-枸橼酸铅染色,采用电子显微镜进行观察。免疫组化PV二步法检测肾脏组织IGF-1、TGF-β1的表达,并采用Image-ProPlus软件分析平均光密度值;使用qRT-PCR技术检测病肾组织内IGF-1mRNA和TGF-β1mRNA;采用ELISA法检测肾盂尿中IGF-1、TGF-β1的水平。结果:1.成功从新西兰兔脂肪组织中分离得到ADSCs,在倒置相差显微镜下,P4代ADSCs形状基本一致,表现为长梭形,涡旋状或放射状生长。本研究采用流式细胞仪对CD90、CD45、CD29、CD34四种表面标志物进行鉴定。结果表明P4代ADSCs中CD90阳性率为96.20%,CD29的阳性率为97.21%,两者为高表达;CD45的阳性率为2.03%,CD34的阳性率为0.36%,两者为低表达。上述表面标志物的表达符合一般表达情况,可用于移植。2.通过肉眼观察发现模型组兔左侧梗阻肾脏随着梗阻时间增长体积显著增大,4周后双侧肾脏体积均显著增大,左侧梗阻肾脏颜色变浅,出现肾盂、肾盏扩张,输尿管变粗,肾实质变薄,皮质和髓质界限模糊,右侧肾脏实质厚度与梗阻前相比无显著变化,肾脏外观形态表明通过梗阻手术病肾积水扩张明显。通过IVU检测发现随着梗阻时间增长,影像获取时间增长,肾盂肾盏和输尿管扩张加重,在梗阻4周时,造影延长至30min显影仍然无法获得清晰影响,肾脏轮廓模糊;梗阻手术后4周模型组动物左侧结扎肾脏肾积水造模成功。通过超声检查发现模型组动物梗阻4周时,左侧梗阻肾脏的长径、宽径、肾盂的前后径均显著大于左侧梗阻手术前肾脏（p＜0.05）,皮质厚度显著下降;解除梗阻4周后双侧肾脏长径、宽径、肾盂的前后径均较第4周时显著减小（P＜0.05）,但仍大于梗阻0周时的径长,肾脏皮质厚度均有所增加,但仍小于梗阻0周时皮质厚度。随着梗阻时间增长,双侧肾脏的门动脉、段动脉和叶动脉的峰值血流速度PSV指数均有所下降,到梗阻第4周时,左侧梗阻肾脏的门动脉、段动脉和叶动脉的峰值血流速度PSV指数较显著降低（P＜0.05）;在解除梗阻4周后,左侧肾脏的上述动脉峰值血流速度PSV指数与梗阻第4周相比显著升高（P＜0.05）,但仍然显著低于第0周时的峰值血流速度PSV指数（P＜0.05）。随着梗阻时间增长,双侧肾脏的门动脉、段动脉和叶动脉的血流阻力均有所增加,到梗阻第4周时,左侧梗阻肾脏的门动脉、段动脉和叶动脉的血流阻力较第0周时显著增加（P＜0.05）,在解除梗阻4周后,左侧肾脏的上述动脉血流阻力与梗阻第4周相比显著减小（P＜0.05）,但仍然显著大于第0周时的血流阻力（P＜0.05）。说明左侧肾脏在进行输尿管结扎后4周肾脏功能受损明显,造模成功;同时在解除梗阻4周后,自然状态下左侧肾脏功能得到了一定程度的恢复,但仍然未完全恢复到梗阻前。3.梗阻解除4周后治疗组的血清肌酐和尿素氮水平显著低于模型组,说明治疗组的肾脏功能的恢复显著高于模型组,且其血清肌酐和尿素氮水平已接近正常范围。治疗组和模型组仍表现为肾盂扩张、尿液潴留,肾脏体积增大,肾皮质变薄,但治疗组肾积水程度显著轻于模型组,假手术组动肾脏无明显病变和肾积水病变;通过光学显微镜对肾脏染色切片进行观察,发现模型组肾小管明显扩张,肾小球的包曼氏囊扩张,同时肾间质纤维化程度严重,并伴随炎症浸润,治疗组肾小管和肾小球的扩张程度轻于模型组,肾间质纤维化程度较模型组轻,炎症浸润减轻;通过电子显微镜观察发现模型组病肾的肾小球上皮细胞出现足突倒伏融合,部分脱落,近曲小管的上皮细胞发生大量线粒体损伤、空泡化,治疗组病肾肾小球上皮细胞倒伏、融合程度轻于模型组,近曲小管上皮细胞空泡化程度轻于模型组;说明在解除梗阻后,治疗组在经过脂肪干细胞治疗后肾脏细胞形态恢复优于模型组,对肾积水导致的肾组织损害恢复有促进作用,这可能是脂肪干细胞能够直接分化为受损组织细胞并进行增值,减少细胞损害和炎症浸润,对肾脏组织进行修复,保护肾脏功能。治疗组肾脏组织中IGF-1、肾盂尿液中IGF-1以及肾脏组织中IGF-1mRNA的表达均显著高于模型组,差异具有统计学意义（P＜0.05）,说明在治疗后,治疗组IGF-1蛋白水平和基因水平在肾梗阻解除后均得到了显著地提高,这对治疗组肾小管上皮细胞的增殖和受损肾脏功能的恢复具有明显的促进作用。治疗组肾脏组织中TGF-β1水平、肾盂尿液中TGF-β1水平和肾脏组织中TGF-β1mRNA表达水平均显著低于模型组,差异具有统计学意义（P＜0.05）,说明在治疗后,治疗组的蛋白水平和基因水平在肾梗阻解除后得到显著下降,这对肾间质纤维化有明显的抑制作用,可以减缓肾脏的形态损害、纤维化和功能损害。结论:脂肪干细胞对新西兰兔肾积水解除后肾脏损害的保护作用机制可能是:一方面,脂肪干细胞拥有强大的分化、增殖功能,能够直接分化为受损靶细胞,如肾小管上皮细胞、肾间质细胞等,加速肾脏组织细胞的修复,促使其形态和功能恢复;另一方面,脂肪干细胞通过肾动脉移植归巢后,在肾脏局部微环境中,能够通过旁分泌作用,上调IGF-1的水平和其mRNA水平,促进自身组织细胞有丝分裂,促进肾小管上皮细胞转分化,促进肾间质细胞的增殖,同时下调TGF-β1水平和其TGF-β1mRNA水平,抑制TGF-β1/Smad,抑制细胞基质聚集发生纤维化,抑制肾间质细胞发生纤维化、减缓肾脏损伤进程,保护肾脏功能。