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目的现有的消化内镜系统显著提高了消化道肿瘤的诊治水平,但在消化道早癌诊断方面,仍然存在微小病灶发现难、边界识别困难、活检局限性等难以解决的问题。针对这些问题,我们开展了消化内镜分子影像学新设备和诊断新技术的研究。前期自主研发的高分辨率显微内镜(High-resolution Microendoscopy,HRME)可显著提高诊断消化道早癌的准确性,但HRME成像光谱单一,临床推广应用受到限制。因此,我们团队研发出了新型的多光谱荧光显微内镜(Multispectral fluorescence microendoscopy,MFE),本研究的目的是将显微内窥成像技术与荧光靶向分子探针结合,应用MFE在细胞水平和动物活体水平对结肠癌病变进行多光谱分子成像,探索高分辨率即时免疫组化成像的新方法。方法采用免疫组化检测结肠癌细胞株HCT116中CD44,EGFR,αvβ3和CD133四种靶蛋白表达,再用软件计算IOD值评估四种靶蛋白表达水平,选择两种相对高表达的靶蛋白作为荧光探针结合靶点。根据应用探针的种类将结肠癌细胞HCT116分为:FITC-anti-CD133组,AF680-anti-αvβ3组,PBS组。应用自主研发的MFE对结肠癌细胞HCT116进行分子成像,计算各组MFE图像中肿瘤细胞平均荧光强度与背景信号的比值(信噪比)。以荧光显微镜作为金标准,应用荧光显微镜对结肠癌细胞HCT116荧光成像,评估MFE在细胞水平多光谱分子成像的可行性。构建裸鼠皮下瘤模型,应用小动物成像仪进行荷瘤鼠活体荧光成像。按探针的种类将动物模型分为:FITC-anti-CD133组,AF680-anti-αvβ3组,PBS组。在不同时间点采集图像,计算各组图像中瘤体的信噪比,评估荧光成像最佳成像时间点和荧光探针在动物模型中的靶向性。为进一步评估荧光探针的靶向性,应用小动物成像仪在最佳时间点拍摄荷瘤鼠的离体组织(瘤,心,肝,脾,肺,肾及小肠),计算探针组与PBS组的离体组织的信噪比。应用MFE对尾静脉注射荧光探针的荷瘤鼠皮下瘤进行分子成像。按探针的种类将动物模型分为:FITC-anti-CD133组,AF680-anti-αvβ3组,PBS组。评估MFE在动物活体水平多光谱分子成像的可行性。更换给药方式,应用MFE对局部喷洒荧光探针的荷瘤鼠皮下瘤进行分子成像,计算各组MFE图像中肿瘤的信噪比,评估不同给药途径对MFE成像效果的影响。采用HE染色法检测裸鼠瘤体标本的组织类型。采用免疫组化检测裸鼠瘤体标本靶蛋白的表达。采用统计学方法比较组间的差异,若P<0.05,则差异存在统计学意义。结果免疫组化证实结肠癌细胞HCT116中四种靶蛋白均表达,经半定量分析表明以CD133和αvβ3两种靶蛋白表达相对较高,将二者作为分子成像的靶点。应用MFE对结肠癌细胞HCT116分子成像,在FITC-anti-CD133组和AF680-anti-αvβ3组的MFE图像中,肿瘤细胞表面有明显的荧光信号,平均荧光强度与背景信号的比值(信噪比)分别为10.137±1.534,13.709±1.672;与之对应的PBS组中无明显的荧光信号,肿瘤细胞信噪比分别为1.585±0.185,2.068±0.227。荧光显微镜图像显示蓝染的肿瘤细胞核和细胞表面绿色或红色的荧光信号,而对应的PBS组中细胞表面无明显的荧光信号。应用小动物成像仪进行荷瘤鼠活体荧光成像,经荷瘤鼠尾静脉注射荧光探针24h后,在FITC-anti-CD133组和AF680-anti-αvβ3组中肿瘤信噪比相对最高分别为1.346±0.005,1.830±0.029;与之对应的PBS组无荧光信号,肿瘤信噪比分别为1.013±0.003,1.016±0.003。在荷瘤鼠离体组织荧光成像中,FITC-anti-CD133组中胆囊的荧光信噪比最高,肿瘤次之比值为2.031±0.038,AF680-anti-αvβ3组中瘤体的荧光信噪比最高比值为2.506±0.018。与之对应的PBS组中瘤体无明显荧光信号,比值分别为1.372±0.018,1.401±0.019。应用MFE对尾静脉注射荧光探针的荷瘤鼠皮下瘤分子成像,图像特点是均匀、高亮的荧光信号遍布整个视野。在FITC-anti-CD133组和AF680-anti-αvβ3组中肿瘤信噪比分别为6.765±0.141,4.738±0.150;与之对应的PBS组中无明显的荧光信号,肿瘤信噪比别为2.711±0.203,2.359±0.196。局部喷洒荧光探针后,荷瘤鼠皮下瘤MFE图像特点是荧光信号呈星星点点状,均匀分布瘤体表面,状似细胞。在FITC-anti-CD133组和AF680-anti-αvβ3组中肿瘤信噪比分别为7.047±0.168,5.905±0.154;与之对应的PBS组中无明显的荧光信号,比值分别为2.498±0.125,1.763±0.043。HE染色结果显示瘤体为结肠癌组织。瘤体免疫组化显示CD133和αvβ3表达。上述的探针组与对应的PBS组之间的比值都不同,且均具备统计学意义(P<0.05)。结论1.应用MFE对结肠癌组织多光谱分子成像研究表明CD133和αvβ3两种靶蛋白可作为结肠癌细胞株HCT116的分子成像靶点,其中CD133首次被用于显微内窥设备分子成像的研究。2.应用自主研发的显微内窥设备MFE,在细胞水平实现对同一种结肠癌细胞株HCT116两种靶点多光谱分子成像。允许MFE进行活体水平多光谱分子成像的研究。3.在活体动物水平,应用自主研发显微内窥设备MFE对裸鼠结肠癌皮下移植瘤实现两种靶点多光谱分子成像,证明MFE具备同时多光谱成像及活体实时免疫组化的可行性。4.比较不同给药方式下裸鼠皮下移植瘤MFE图像差异,结果表明局部喷洒探针的MFE图像效果更理想,局部喷洒荧光探针可能作为MFE未来临床应用的最佳给药方式。