本文包括异源四倍体烟草基因组稳定性研究和紫背天葵叶背面红色形成机理分析两部分研究内容:1.异源四倍体烟草基因组稳定性研究植物存在精细的机制控制和修复突变,从而保持物种的稳定性。在绝大多数情况下,人们很难在实验室检测到植物基因组突变的发生,阻碍了我们对突变及物种进化的了解。本论文应用了一套新颖的方法,可在实验室检测功能缺失突变的发生并计算其频率,利用该方法分析了烟草基因组的稳定性,主要结果如下:(1)应用一套新的方法高通量鉴定基因功能缺失突变体。首先获得转TMV无毒基因(P50)的转基因植株。该转基因植株与含抗病基因N的植株杂交。F1种子同时含有抗病基因N及其对应的无毒基因P50,发芽后一周内幼苗发生程序化细胞死亡。只有无毒基因或抗病基因发生功能缺失突变,F1植株才能存活。这两个基因的突变可通过TMV接种进行区分。(2)通过人工去雄杂交获得约1,400万粒上述F1杂交种子。对存活F1植株进行TMV接种及PCR鉴定,共获得2,134个N基因突变体,突变率为1/6,600。与N基因类似,P50(转基因)功能丢失频率为1/6,500。本论文主要研究P50功能丢失的机理以及对N基因突变体序列的分析。(3)随机挑选261个P50基因功能缺失突变体,检测到其中23个突变体的P50序列发生突变,105个突变体在P50基因所在染色体有大片段缺失(频率为1/16,000),133个突变体的P50所在染色体全部缺失(频率为1/13,000)。未发现P50插入染色体与其同祖染色体(homeologous chromosome)发生交换。这一结果与N基因所在染色体频繁发生同祖交换截然相反,说明基因组不同染色体的进化方式存在显著差异。(4)挑选一个P50基因突变体进行深入分析。该突变体存在大片段缺失,通过一系列分子标记筛选将缺失边界定位在1 kb之内,然后PCR扩增修复位点获得断裂区域的序列。序列分析结果表明两个断裂点所在区域没有同源性,因此,片段丢失后是通过非同源末端连接(NHEJ)进行修复的。(5)通过上述自然突变筛选到9个N基因的点突变和5个小片段插入缺失突变。据此推算烟草基因组中每代每个位点发生小片段插入缺失的突变率为5.3×10-11。通过EMS处理Samsun(NN)植株的花粉,获得6个N基因的点突变体。对共15个点突变体的分析发现,N蛋白的多个结构域中氨基酸改变可导致其功能丧失。2.紫背天葵(Gynura bicolor)叶背面红色形成机理研究紫背天葵是菊三七属多年生草本植物,具有较高的营养价值。紫背天葵叶背面(远轴面)表皮细胞中由于花青素的积累呈现紫红色,而叶正面(近轴面)为绿色,形成一种奇特的叶色分布,其形成机理仍不清楚。本研究利用RNA-seq方法,探讨紫背天葵叶两面颜色差异形成的分子机理。主要研究结果如下:(1)首先,分别从紫背天葵和白背天葵(G.divaricate)的叶正面和背面表皮细胞中提取总RNA,对4个样品进行转录组测序。将RNA序列从头拼接,在紫背天葵中得到189,196个unigenes,在白背天葵中得到147,686个unigenes。(2)紫背天葵叶正/背面表皮细胞中共存在3,588差异表达基因,大大高于白背天葵差异表达基因数(514)。两个物种共有417个相同的差异表达基因,这些基因包括已知的叶背特异表达基因,如AS2、ARF4、KAN、YABBY2等。这些共同差异表达基因可能反映组织特异性,与颜色形成没有直接关系。(3)在紫背天葵叶正/背面表皮细胞差异表达但在白背天葵中不存在差异表达的基因,共有3,171个,包括4个花青素合成途径基因:F3’H,CHS,DFR和LDOX,表明紫背天葵的叶背面颜色是由于花青素代谢途径的激活而产生的。(4)详细分析了紫背天葵中的MYB,bHLH及WD40家族,发现一个bHLH转录因子在叶背表皮细胞中大量表达,但在紫背天葵叶正面以及白背天葵叶正背面的表达量都很低,该转录因子与拟南芥中的花青素调控因子bHLH42为直系同源体。我们推测该bHLH转录因子在紫背天葵叶背面的高度表达导致花青素合成途径多个基因的上调表达,进而合成大量的紫色花青素。