【摘 要】
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相对于大肠杆菌原核表达系统,乳酸菌表达系统还不够成熟,主要表现在外源蛋白的表达量较低、乳酸菌的某些遗传背景不够清楚,操作比较繁琐,表达条件相对不够稳定等,因此探索乳酸菌载
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相对于大肠杆菌原核表达系统,乳酸菌表达系统还不够成熟,主要表现在外源蛋白的表达量较低、乳酸菌的某些遗传背景不够清楚,操作比较繁琐,表达条件相对不够稳定等,因此探索乳酸菌载体系统适宜的表达条件,提高表达量,建立乳酸菌表达系统的技术平台,对表达的外源蛋白更有效的发挥作用具有重要的实践意义。
本试验对乳酸杆菌pPG质粒表达系统理想表达条件进行了探索,以干酪乳杆菌 Lactobacillus casei 393为宿主菌,β-葡萄糖苷酸酶(gusA)基因作为表达的报告基因,探索了其表达过程中诱导物种类、诱导物浓度、诱导时间、培养基pH、培养方式等各个影响表达的关键因素进行了研究。试验结果表明,活化的种子菌以1%接种于MRS液体培养基,并用1%乳糖为诱导物,初始培养基pH值在6.0~7.0之间,30℃或32℃,静止培养约7~8小时,菌液浓度至A<,590>OD达0.5,表达效率最高,外源蛋白的表达量可占菌体总蛋白的14%。分泌表达载体干酪乳杆菌pPG-2-/L.393上清液分别经4℃透析和冷冻干燥浓缩50倍后,West blot未检测到目的蛋白,而将pPG-2/L.393的菌体沉淀经West blot检测后出现明显的目的带,由此说明干酪乳杆菌pPG-2/L.393表达的gusA目的蛋白仍结合在菌体上:培养基中葡萄糖的浓度对gusA的表达有抑制作用。当葡萄糖终浓度为0.1%以下时对pPG-1/L.393表达gusA未见明显影响,而当其含量达到0.5%时,表达量明显下降,至葡萄糖浓度达到2%时,基本看不到gusA的表达。试验通过对乳酸杆菌pPG质粒表达系统理想表达条件的探索为更好利用该系统表达活性蛋白(肽类)奠定了基础。
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