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随着分子免疫学的发展,C57 BL/6小鼠成为了研究免疫学、肿瘤学、遗传学的常用实验品系,该小鼠易于繁殖,体格健壮,试验结果精度高。免疫缺陷动物是指先天性遗传或者人为地造成免疫缺陷地动物,常用于肿瘤、病理、抗癌药物、基因治疗,是进行生物医学研究的有利工具。本研究利用CRISPR/Cas9技术构建了C57 BL/6小鼠免疫缺陷动物模型,对其免疫特性进行研究,探索免疫细胞在动物模型中的表达规律。论文的主要内容如下:1、构建lyst基因缺陷C57 BL/6小鼠动物模型溶酶体运输调节因子基因(lysosomal trafficking regulator gene,lyst)是先天性白细胞颗粒异常综合征(Chediak-Higashi综合征)的致病基因,患病机体的临床表现为:色素减退,免疫缺陷、畏光羞明,轻度凝血障碍等。本研究采用CRISPR/Cas9技术针对C57BL/6小鼠lyst基因编码区第50个外显子,设计靶点引物(sgRNA),并重组构建pUC57-lyst-sgRNA载体。将重组质粒与Cas9质粒分别利用T7 RNA聚合酶体外转录为mRNA,注射入小鼠受精卵,将其移植到受体小鼠。获得子代小鼠后,利用PCR和基因测序技术,筛选lyst基因编辑的动物个体,通过生物信息分析软件判断基因发生的缺失、突变或插入,并用流式细胞检测其免疫特性;根据基因型同源性合笼近亲繁殖;最终获lyst基因缺陷C57 BL/6小鼠。试验结果,利用CRISPR/Cas9技术构建lyst基因缺陷C57BL/6小鼠,其NK细胞数量与同品系野生小鼠相比减少,部分缺陷小鼠毛色与同品系野生型小鼠毛色相比颜色变淡,与文献报道相符。为后续NK细胞免疫缺陷的人源化肿瘤研究及C57 BL/6小鼠严重联合免疫缺陷动物模型奠定基础。2、构建prkdc基因缺陷C57 BL/6小鼠动物模型DNA依赖性蛋白激酶基因(DNA-dependent protein kinas,prkdc)功能障碍可直接影响T、B细胞的表达,使得机体产生严重联合免疫缺陷。本研究采用CRISPR/Cas9技术针对C57 BL/6小鼠prkdc基因编码区第85个外显子,设计靶点引物(sgRNA),并重组构建pUC57-prkdc-sgRNA载体。将重组质粒体与Cas9质粒分别利用T7 RNA聚合酶体外转录为mRNA,注射入小鼠受精卵,将其移植到受体小鼠。获子代小鼠后,利用PCR检测技术和基因测序技术,筛选prkdc基因编辑的动物个体,对基因组编辑的小鼠根据基因型同源性合笼近亲繁殖。实验结果:最终构建了prkdc基因缺陷C57 BL/6小鼠,其T、B细胞的数量与同品系野生小鼠相比减少,甚至出现T、B细胞量几乎为零的小鼠,基因编辑小鼠生长缓慢与文献报道相符。可用于T、B细胞免疫缺陷的人源化肿瘤研究,为基因治疗及C57 BL/6小鼠严重联合免疫缺陷动物模型奠定基础。综上所述,利用CRISPR/Cas9技术,分别构建了C57 BL/6小鼠的lyst基因和prkdc基因的免疫缺陷动物模型,该小鼠模型体内免疫细胞数量降低。为下一步进行人源化肿瘤研究、构建C57 BL/6小鼠严重联合免疫缺陷动物模型及分子免疫的研究奠定基础。