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研究背景：非酒精性脂肪性肝病(nonalcoholic fatty liver disease, NAFLD)是遗传—环境—代谢应激相关性肝病,包括单纯性脂肪肝(simple steatosis,SS)、脂肪性肝炎(nonalcoholic steatohepatitis,NASH)和肝硬化。NAFLD是构成代谢综合征(metabolic syndrome,MS)的主要条件,它可以是一个独立的疾病,但更多见的还是全身性疾患在肝脏的病理过程。NAFLD发病率逐年上升,发病年龄也日趋年轻化,其预后不再是单一的良性经过,很有可能发展为肝硬化、肝癌甚至相关死亡。NAFLD发病机制复杂,目前尚未十分清楚,普遍为人们所接受的是“二次打击”假说,但不能解释NAFLD发生发展过程中的所有问题,近年研究也表明,约10～20%的NAFLD患者无胰岛素抵抗(insulin resistance,IR),约50%的NAFLD未完全符合MS的诊断标准,那么我们推测,NAFLD的形成和发展可能有更多次的打击或还有未知的启动因素。根据不同原因导致的肝细胞损伤,都源于肝细胞的死亡,而肝细胞死亡基础为坏死与凋亡二种模式,业已证明,在非酒精性脂肪肝患者中,其Fas表达和肝细胞的凋亡是增加的。最新研究发现,不饱和脂肪酸(尤其是多不饱和脂肪酸)对肝脏有保护作用,而饱和脂肪酸对肝脏有毒性作用。NAFLD患者体内,软脂酸是含量最多的一种饱和脂肪酸。结合近年在肿瘤形成和免疫调节等领域研究发现：FoxO (Forkhead box-containing protein, class O)转录因子在细胞周期、新陈代谢、DNA修复、细胞凋亡、抵抗氧化应激、长寿等方面发挥重要的调节作用。其家族成员FoxO3a有促进靶基因如FasL, Bim、p130和Cdkn1b/p27的表达,导致细胞凋亡。当被激酶磷酸化后,FoxO3a就转出细胞核,进入胞浆,与蛋白14-3-3结合,失去促凋亡活性,而得以肯定。因此,我们推测肝细胞软脂酸的堆积和FoxO3a参与调控细胞凋亡可能是NAFLD的重要发病机制。基于上述学术假设,结合我们近年有关脂肪肝发病机理研究所获的信息,本研究从以下三个部分渐次深入地探讨NAFLD细胞死亡的细胞与生物学基础,相关问题的阐明可望为揭示NAFLD的发病机制,为病情进展的干预和并发症的预防提供理论依据。方法：一、软脂酸诱导肝细胞内脂肪沉积和对肝细胞凋亡的影响1、构建细胞模型：选择人肝癌细胞株HepG2.2.15细胞和L02细胞作为研究对象,通过软脂酸诱导肝细胞发生脂肪变性,检测细胞内TG(甘油三酯)含量及油红O染色鉴定细胞模型构建成功与否。2、细胞分组：不同浓度的软脂酸(100μmol/L、200μmol/L 400μmol/L、600μmol/L)培养24h和400μmol/L软脂酸培养6、12、24、48h。3、采用MTT法、Vexinv-FITC/PI双染流式细胞术和Caspase3检测试剂盒,观察HepG2.2.15细胞、L02细胞的存活率、凋亡率及Caspase3活性。4、RT-PCR检测HepG2.2.15细胞的Bim mRNA、p27kip1 mRNA; Western Blot方法检测总FoxO3a和p-FoxO3a (Thr32)蛋白。二、FoxO3asiRNAl在软脂酸诱导HepG2.2.15细胞凋亡中的作用1、FoxO3a小干扰RNA的筛选①引物合成：根据人FoxO3a的基因序列,设计并化学合成3条siRNA引物(P1,P2,P3)及随机阴性对照(siRNA-NC)。②细胞转染：将siRNA-NC-FAM转染HepG2.2.15细胞,通过倒置荧光显微镜筛选siRNA的转染浓度。③RT-PCR方法：检测FoxO3a mRNA的表达,筛选最有效靶向FoxO3a的siRNA的序列。④Western Blot方法：验证转染抑制效果最好序列的细胞的FoxO3a蛋白的表达。2、软脂酸与转染FoxO3a siRNA1的HepG2.2.15细胞的培养将HepG2.2.15细胞分五组：(1)mock组：先加脂质体LipofectamineTM 2000作用6小时,继续培养细胞48小时。(2)P1：转染FoxO3a siRNA1,培养54h。(3)P1+PA组：转染FoxO3a siRNAl 48小时后,400μmol/L软脂酸培养6小时。(4)NC组：转染siRNA-NC后,培养54小时。(5)NC+PA组：转染siRNA-NC48小时后,400μmol/L软脂酸培养6小时。三、FOXO3a在非酒精性脂肪性肝病患者外周血单个核细胞中的表达及其与疾病活动性的关系1、收集符合非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)诊断的患者42例,其中非酒精性单纯性脂肪肝(SS)20例、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)22例；另选健康体检者20例为对照组。2、RT-PCR检测NAFLD患者外周血单个核细胞FoxO3a mRNA、Bim mRNA、p27kip1 mRNA。3、分析各组之间各指标的差异并对各指标与FoxO3a mRNA进行线性多元回归分析。结果1、细胞内脂滴和TG含量随时间增加而逐渐增加。2、随着软脂酸浓度的逐渐增加,细胞存活率逐渐下降,而凋亡率、Caspase3活性逐渐增加,并皆与浓度相关。3、随着软脂酸培养时间的延长,细胞存活率逐渐下降；而凋亡率、Caspase3活性逐渐增加,并皆与时间相关。4、随着软脂酸培养时间的延长,Bim mRNA、p27kipl mRNA的表达逐渐增加；各组HepG2.2.15细胞总FoxO3a蛋白无明显改变、p-FoxO3a蛋白随作用时间延长逐渐减少。HepG2.2.15细胞FoxO3a蛋白表达明显高于L02细胞。5、siRNA在50nmol/L时荧光最强。6、P1(FoxO3asiRNA1)、P2 (FoxO3asiRNA2)组对FoxO3a mRNA均有抑制作用(P<0.05),随着时间的延长抑制增强(P<0.05)。P3(FoxO3asiRNA3)组siRNA无明显抑制作用(P>0.05)。P1(siRNA1)的抑制效果最好。P1组FoxO3a蛋白表达随时间逐渐下降；7、P1组细胞核的绿色荧光非常弱,细胞浆的绿色荧光较强；P1+PA组细胞核的绿色荧光有所增加,细胞浆的绿色荧光减少；8、NC组、P1组、mock组凋亡率、Caspase3活性无明显改变(P>0.05)。P1+PA组与NC+PA组相比,凋亡率、Caspase3活性下降(P<0.05)。9、NC组、P1组、mock组Bim mRNA、p27kip1 mRNA表达无明显差异(P>0.05)。P1+PA组比NC+PA组表达明显减少(P<0.05)。10、P1+PA组、P1组总FoxO3a蛋白明显减少(P<0.05),而其它各组基本相同。mock组和NC组p-FoxO3a蛋白基本相同,而NC组+PA组最低,P1+PA组较P1组p-FoxO3a蛋白减少。11、临床研究：除年龄以及身高外,NAFLD患者与健康对照组的BMI、WHR、FFA、HDL-C、TC、TG、LDL-C、GPT差别皆有统计学意义(P<0.05或P<0.001)。而NASH组BMI、WHR、LDL-C、FFA、HDL-C、TC、GPT高于SS组(P<0.05或P<0.001)；健康对照组、SS组和NASH组的FOXO3a mRNA和Bim mRNA、p27kip1 mRNA表达逐渐增加(P<0.05或P<0.001)；FoxO3a mRNA与Bim mRNA呈线性相关。经多元线性回归分析得出WHR、FFA、TG、BMI、LDL-C与FOXO3a mRNA相关性大,而其中以腰臀比(WHR)的影响最大(复相关系数R=0.953,决定系数R2=0.908)。在经调整饮食、控制体重和服用降脂药物等综合治疗后,WHR、血脂等较治疗前明显好转(P<0.05或P<0.001),FoxO3a mRNA表达下降(t=23.25,P<0.05)。结论：1、软脂酸可诱导细胞脂肪变性和凋亡,并对细胞存活率、凋亡率、Caspase3活性的影响呈浓度和时间依赖性。2、软脂酸可引起促凋亡因子Bim、p27kip1明显上调,导致凋亡的发生。3、软脂酸可活化转录因子FoxO3a, HepG2.2.15细胞高表达FoxO3a。4、FoxO3a siRNA1的抑制效果最好5、FoxO3a siRNA1单独不能诱导HepG2.2.15细胞凋亡,在软脂酸刺激下针对FoxO3a的siRNA1能通过降低Caspase3活性、抑制Bim、p27kip1的表达,从而减少细胞的凋亡。软脂酸通过促进FoxO3a去磷酸化(失活)和核移位而调节凋亡6. NAFLD患者血脂明显增加,FoxO3a mRNA在NAFLD外周血单个核细胞表达升高,随病情的加重而增加,并且与凋亡因子Bim有线性关系。血脂高低对其表达有影响。