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目的1构建PRL-3过表达慢病毒重组质粒表达载体并鉴定,研究过表达PRL-3引起Stathmin的表达变化对K562及U937白血病细胞生物学活性的影响。2初步探讨过表达PRL-3引起Stathmin的表达变化影响白血病细胞生物学特性改变的可能分子机制。方法1构建PRL-3过表达慢病毒重组质粒载体系统pGC-FU-PRL-3-GFP,采用测序、Western blot等方法鉴定重组载体。2以AML细胞K562、U937为实验细胞株,感染pGC-FU-PRL-3-GFP的细胞为过表达组(over-expression,OE组),感染pGC-FU-GFP的细胞为空载体对照组(negative control,NC组),未感染病毒的细胞为空白对照组(control group,CON组)。使用嘌呤霉素筛选稳转株,通过qPCR及Western blot鉴定PRL-3 mRNA及蛋白改变水平;检测PRL-3过表达后Stathmin表达变化。3间接免疫荧光标记PRL-3和Stathmin后,荧光显微镜分析二者在实验细胞株中定位情况。4采用MTS法、细胞克隆形成实验、DNA倍体分析法、AnnexinV-PE/7-AAD双染法以及Transwell转移侵袭实验检测PRL-3过表达后K562和U937细胞的增殖、周期、凋亡以及转移侵袭等生物学活性的变化。5运用Western blot检测过表达PRL-3引起Stathmin表达变化后,Stathmin四个磷酸化位点Ser16、25、38、63的蛋白表达变化;检测STAT信号通路蛋白STAT3、STAT5及其磷酸化蛋白表达变化;检测基质金属蛋白酶MMP2、MMP9的表达变化;分析探讨过表达PRL-3引起Stathmin的表达变化影响AML细胞生物学活性的可能分子机制。结果1成功构建PRL-3过表达慢病毒载体并鉴定。2 PRL-3过表达慢病毒感染AML细胞U937和K562 48h后,观察到GFP的表达。嘌呤霉素筛选出稳转株,qPCR及Western blot检测显示:各OE组细胞PRL-3在mRNA和蛋白水平表达上调,PRL-3过表达成功。3过表达PRL-3后,各OE组细胞较NC组细胞Stathmin mRNA和蛋白表达均明显上调(U937 P<0.01,K562 P<0.05)。4间接免疫荧光检测显示:PRL-3与Stathmin蛋白于细胞内定位相近。5.与U937-NC组相比,U937-OE组细胞增殖速度加快(P<0.05)、细胞克隆形成率增高(P<0.01);处于S期的细胞比例明显增多(P<0.05)、总凋亡率减少(P<0.01);迁移率和侵袭穿膜细胞明显增多(P<0.05)。而在K562细胞中,OE组与NC组细胞的上述生物学活性指标均无明显变化(P>0.05)。5与U937-NC组细胞相比,U937-OE组细胞中Stathmin Ser16、25、38、63四个位点的磷酸化蛋白表达水平呈现不同程度的下调(P<0.01),STAT3、STAT5磷酸化水平及MMP2、MMP9蛋白表达水平均上调(P<0.01)。而在K562-OE组细胞中,仅Stathmin Ser25磷酸化蛋白表达水平下调(P<0.05),Ser16、38、63三个位点的磷酸化蛋白表达水平无明显变化(P>0.05);STAT3、STAT5磷酸化水平无明显差异(P>0.05);MMP2、MMP9蛋白表达水平上调(P<0.05)。结论1成功构建了PRL-3过表达慢病毒载体。2在U937细胞中,过表达PRL-3可引起Stathmin的表达增加,S期细胞增多,细胞增殖增加、凋亡减少,迁移和侵袭力增强等生物学活性改变。Stathmin的四个磷酸化蛋白去磷酸化增强,STAT信号通路激活,MMP2、MMP9蛋白的表达增加。3在K562细胞中,过表达PRL-3也可引起Stathmin的表达增多,Stathmin Ser25去磷酸化增强,MMP2、MMP9蛋白激活,STAT3、STAT5磷酸化水平无变化,细胞生物学活性无明显改变。4 Stathmin可能是介导PRL-3对AML细胞生物学活性影响的一个靶点。