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目的:缺氧微环境与肿瘤放疗抵抗性密切相关。缺氧诱导了一系列基因的表达,如缺氧诱导因子-1(HIF-1)和血管内皮生长因子(VEGF)。HIF-1诱导下游一系列基因(包括VEGF)的表达,从而促进肿瘤进一步发生发展。肿瘤细胞内HIF-1和VEGF的高表达与肿瘤的放疗抵抗性相关,这预示着这些基因可能是潜在的治疗靶点,抑制它们的表达也许能提高放疗的敏感性。为了进一步验证这个可能性,我们研究了肿瘤细胞内抑制这两个基因表达和放疗敏感性之间的关系。既然三维肿瘤模型(spheroid)与单层细胞培养相比,可以模拟实体肿瘤的特点,它在离体情况下可以提供一个很好的三维模型,可以产生缺氧,从而用于研究对放疗和各种化学物质的反应。我们用离体三维肿瘤模型和小分子干扰技术(siRNA)进行试验。材料和方法: SQ5细胞培养至95%浓度后,在专用agarose覆盖培养皿上每5000个细胞种植,4天后形成直径500um的三维立体模型(spheroids)。为了获得裸鼠肿瘤模型,7-9周大小的BALB/c裸鼠背部皮下注射SQ5细胞数1.0×10~7,大约15天后取出肿瘤组织,测量其直径。单细胞采用顺行方法(Forward transfection)转染siRNA,即转染前24h先培养细胞,40-mm培养皿中加入8x10~4细胞数,再转染siRNA,浓度100 nM。培养24小时后检测。对spheroids采用反向转染方法(Reverse transfection),即先在单细胞水平转染siRNA,再形成spheroid,转染浓度是50 nM,转染介导物是lipofectamine。单细胞和spheroid缺氧培养用GaspakTM Pouch Anaerobic System或者Anaero Pack System,快速产生低氧的环境。培养皿或者培养板用塑料袋密闭,放射照射前培养6h/24h。细胞照射用Cs-137 Gamma Cell irradiator,常温条件,低氧或者常氧。照射剂量从0～8 Gy ,速度1Gy/min.照射后细胞很快置于冰上,以防止再氧化发生。用定量RT-PCR和Western Blotting进行基因表达分析。细胞毒性反应用克隆形成实验检测。结果:首先比较单层细胞,三维肿瘤模型和实体肿瘤中HIF-1和VEGF mRNA和HIF-1蛋白质的表达。定量RT-PCR结果发现三种肿瘤模型中HIF-1和VEGF mRNA均高表达,用Western Blotting方法检测发现在单细胞中只有微量的HIF-1蛋白质表达,而在spheroid中,HIF-1蛋白质明显升高,与裸鼠肿瘤中的表达相当,证明三维球体增加了HIF-1蛋白质的表达。其次,分析了在常氧和低氧条件下,单层细胞和spehriod球体中siRNA对相应的HIF-1和VEGF的抑制表达效果。RT-PCR结果显示,对单层细胞而言,缺氧培养24h后,HIF-1 mRNA明显升高,而且HIF siRNA转染后,HIF-1 mRNA明显受到抑制,而VEGF也是相类似的结果。但转染抑制的效果,相对HIF-1而言,程度稍轻。同单层细胞比较,三维模型spheroids在低氧培养6h后,明显提高了HIF-1 mRNA和VEGF mRNA表达,并且受到相对应的siRNA转染后的抑制表达。缺氧培养增加了HIF-1和VEGF mRNA的表达,然后,用Western Blotting方法在蛋白质水平进一步验证,发现单层细胞在常氧条件下没有HIF-1蛋白质的表达;尽管在缺氧24h后单层细胞SQ5内HIF-1 mRNA高表达,HIF siRNA出理后,基本上受到抑制。对Spheroid而言,常氧和低氧均有HIF-1蛋白质的表达,而且低氧条件下表达量增加,但是在两种条件下,用HIF siRNA转染后,均导致蛋白质表达受限。Spheroid的蛋白质验证与上述RT-PCR结果相对应。Spheroid放射照射结果显示,在缺氧条件下对放疗抵抗性增加;同时常氧和缺氧条件下显示,放疗结合siRNA处理并没有增加细胞的毒性反应。结论:多细胞三维模型spheroid,在离体时可以模拟实体肿瘤的三维特点,可以用来评价和预测肿瘤对siRNA干扰后对HIF-1 mRNA和VEGF mRNA的反应和效果;我们建立了一个将siRNA转染进入spheroid模型的方法,由于三维肿瘤模型细胞致密,排列紧密,分子很难弥散进入,因此我们用反向方法转染成功;我们的实验结果显示在常氧或者缺氧条件下,三维肿瘤模型spheroid中HIF-1或VEGF的功能看来与放疗敏感性没有关系。这可能是三维肿瘤模型虽然具有实体肿瘤的特点,但是也存在着缺陷,即不能模拟实体肿瘤的血管微环境;另外,我们的实验是采用单次剂量照射的方法,而实际上放疗是分段性照射,从而有再氧化的出现,因此,我们下面将进行进一步的实验,即在动物水平进行,以及分段性照射后研究HIF-1和/或VEGF与照射的放射敏感性之间的关系。