革兰阴性杆菌是引起人类感染性疾病的主要病原之一。在感染性疾病的病原构成中占有重要的地位,同时,革兰阴性杆菌对临床常用抗菌药物耐药性日益严重,其中产超广谱β-内酰胺酶的革兰阴性杆菌在临床上分离率高,所致感染治疗困难,是当前最受关注的耐药菌。由于耐药菌所致感染的病死率高于敏感菌,可选用的药物种类有限,而有效治疗的延误可导致治愈率下降,重症感染病死率升高,故早期、正确的病原学诊断是提高感染性疾病治疗水平的关键,并可减少抗菌药物的滥用,进而减少不良反应的发生,延缓耐药性的发生与蔓延,同时可大幅度减少医疗费用。由于常规病原学诊断方法包括标本中细菌培养、分离以及药敏,所需时间长,难以及时指导感染性疾病的病原治疗。而随着分子生物学与细菌基因组学的发展,快速、灵敏的核酸检测方法已开始用于某些耐药基因的检测,且逐渐被人们所接受。本课题在分析临床常见病原菌共有的23S rRNA基因以及革兰阴性杆菌主要耐药基因的基础上,建立了可用于检测耐药革兰阴性杆菌的快速基因诊断方法,并应用于临床,此有望为耐药菌感染早期病原诊断和及时正确的抗感染治疗提供客观依据。 第一部分 临床常见病原菌分子生物学鉴定方法研究 核糖体核糖核酸(ribosomal RNA, rRNA)基因是细菌生存必需的基因序列,而且在进化过程中较为保守。细菌的rRNA基因由5S、16S以及23S rRNA基因三部分构成。其基因序列特点为保守区和多变区相互间隔排列,多变区序列在不同种类细菌中各不相同,从而可提供区分不同细菌的重要信息,可用于细菌的进一步区分和鉴定;利用基因序列保守区可设计通用引物,使同时扩增、检测多种细菌相关基因序列成为可能。以往应用16S rRNA基因检测细菌较多,近年来23S rRNA基因的应用有所增多。此部分研究的目的是明确23S rRNA基因用于临床常见致病菌鉴定的可行性,首先利用多变区两端的保守序列使用一对通用引物,扩增13种临床常见致病菌的23S rRNA基因部分序列,包括:金黄色葡萄球菌、凝固酶阴性葡萄球菌、粪肠球菌、屎肠球菌、肺炎链球菌、大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌、变形杆菌属、阴沟肠杆菌、鲍曼不动杆菌、铜绿假单胞菌、嗜麦芽窄食单胞菌和洋葱伯克霍尔德菌,并对部分菌种先前未知序列测序,使用DNAStar软件进行分析同源性,结果显示13种临床常见致病菌的23S rRNA基因序列存在较多差异,根据不同菌株在该基因片段的特异序列,分别设计了相应探针,并固定于尼龙膜上;在通用引物上标记地高辛,建立PCR-反向杂交-地高辛显色检