先天性心脏病（Congenital Heart Disease,CHD;简称,先心病）是最常见的出生缺陷之一,2015年统计发现,欧美国家先心病的发病率达到了千分之二,而我国每年约有15万先心病婴儿诞生。心脏是脊椎动物发育过程中最早形成的重要器官之一,也是最早开始行使功能的器官之一。先天性心脏病中,有25%～30%为心脏瓣膜异常,其中Holt-Oram综合征（心手综合征,HOS）是瓣膜缺陷类先天性心脏病。其主要病因之一是转录因子Tbx5（T-box 5）的缺失,从而导致严重的心脏瓣膜发育异常,造成心脏功能缺陷。Tbx5基因属于T-box家族,该家族成员都包含一个独特的DNA结合结构域,其各个成员编码的转录因子在胚胎发育中发挥重要作用。在早期胚胎发育阶段,T-box基因家族在脊椎动物心脏发育中起重要作用,主要作用于脊椎动物的早期心脏谱系决定、心室特化、房室分隔和胚胎传导系统分化等。其中,Tbx5是近年来在心脏发育领域研究较多的基因。Tbx5的缺失是导致HOS先天性心脏病的重要原因之一,但其致病机制和Tbx5在心脏发育过程中的结合因子的研究,目前尚未研究明确。本论文通过研究Tbx5与Kctd10及Nkx2.5在心脏发育中的相互作用关系,对心手综合征的干预和先心病致病机理的认识具有重要意义。本论文对tbx5的研究主要分为两个方面。一方面,2014年北大实验室发现Kctd10的突变会导致Tbx5a过度活化,从而影响了has2（hyaluronan synthase 2）在斑马鱼心胶质层的表达,进而导致了心脏的畸形。本文在此基础上深入探究Kctd10与Tbx5a的相互作用关系,我们首先通过CRISPR/Cas9技术成功的在斑马鱼中构建了tbx5a基因突变鱼系,利用T7E1检测并筛选到tbx5a F1可遗传的杂合子后,与kctd10突变杂合子交配获得双基因突变体。本论文通过心脏转基因鱼系（cmlc2:EGFP;flk:m Cherry）进行表型分析,发现双基因突变体既部分缓解了kctd10突变体在房室间隔处的异常紧缩,又部分缓解了tbx5a明显的环化异常表型。本论文进一步把kctd10和tbx5a两个基因按不同的功能域进行了分段克隆,Co-IP实验表明Kctd10通过其△BTB结构域与Tbx5a的转录激活TAD2结构域结合,进而发挥作用。本论文成功揭示了Kctd10与Tbx5a相互作用的具体结合机制,并通过抑制kctd10部分缓解了tbx5a（HOS）的心脏异常表型,深化了对心手综合征致病机理的认识。另一方面,Tbx5和Nkx2.5都是在各物种中高度保守的转录因子,两个基因在人、小鼠和斑马鱼上有着高度同源的结构和功能,在早期胚胎心脏发育发面起着重要的作用。Nkx2.5基因的表达也是早期心脏发育开始的标志基因之一,在心脏发育过程中依照时空顺序进行表达。基因nppa是心脏发育相关的下游靶基因,与心脏环化及腔室形成过程密切相关。我们设计并合成了心脏靶基因nppa 2kb的启动子,将其连入p GL3-luciferase载体中,成功构建了nppa-luc荧光素酶报告基因表达质粒。随后利用荧光素酶报告基因检测实验（luciferase）验证了tbx5a与nkx2.5间的作用关系。luciferase实验表明,tbx5a与nkx2.5均可激活下游基因nppa的表达（分别为2倍,1.7倍,p<0.01）,并且tbx5a和nkx2.5共同激活nppa的作用最强（12倍,p<0.001）。同时我们通过使用Tbx5a不同的功能结构域与Nkx2.5作用,将DB domain和AD domain分别同时与Nkx2.5、nppa-luc转入到HEK293t细胞当中,发现两者均不能与Nkx2.5共同激活下游基因nppa的表达。该实验表明Tbx5a需要在两个功能域同时存在的条件下才能成功的与Nkx2.5结合并激活nppa的表达。综上,本论文一方面通过CRISPR/Cas9技术成功敲除了tbx5a基因,并利用突变鱼系杂合子交配获得了kctd10和tbx5a的双突变体。随后通过表型观察分析发现tbx5a和kctd10的双突变体既缓解了kctd10突变体尤其在房室间隔处的异常紧缩,又部分缓解了tbx5a明显的环化异常表型。同时本文分段克隆了两个基因不同的功能域,Co-IP实验初步揭示了Kctd10与Tbx5的结合位置及相互作用机制,深化了对心脏发育机制以及先心病致病机理的认识。另一方面,本论文设计并合成了nppa的启动子,并初步得出了Tbx5a需要DB domain和TAD domain共同存在的情况下与Nkx2.5形成聚合物,激活下游心脏靶基因nppa的表达。本文在Tbx5a与Nkx2.5的相互作用机制的研究上有了初步的解析,深化了Tbx5a与Nkx2.5之间的结合作用关系。同时nppa-luc表达载体的构建也为心脏信号转导网络的后续研究提供了一定的实验材料基础。