【摘 要】
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该文通过一种改进后的方法,即通过缩短DEAE-cellulose-52柱的长度,以及提高洗脱液的pH,可在9h内从菠菜、菜心和豆角绿叶中纯化GO同工酶.证实该GO同工酶具高活性(90~197.U/mg.
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该文通过一种改进后的方法,即通过缩短DEAE-cellulose-52柱的长度,以及提高洗脱液的pH,可在9h内从菠菜、菜心和豆角绿叶中纯化GO同工酶.证实该GO同工酶具高活性(90~197.U/mg.min)和高pI(pI>10.0).SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)表明,该GO同工酶均有40kD主带.初步证实不同植物中的GO同工酶的亚基Mr是相同的.多次纯化菜心中的GO同工酶.醋酸薄膜电泳表明其pI>10.0,而等电聚焦电泳(IEF-PAGE)则表明,该GO同工酶可产生从4.5~10.0的近10种pI.在SDS-PAGE电泳中,GO同工酶始终只存在40kD主带,表明GO同工酶pI的变化与40kD亚基降解无关.菜心GO同工酶的SDS-PAGE和SDS-毛细管电泳(CE-SDS)显示,该酶除了含40kD主带外,还有很浅的66kD带,和之前我们提出的菠菜GO同工酶含40kD酸性亚基和66kDD碱性亚基相似;SDDS-PAGE和CE-SDS电泳中,无论加入β-巯基乙醇与否,GO同工酶都只有40kDD主带和66kD浅带,表明菜心GO同工酶中40kDD酸性亚基和66kD碱性亚基不是以共价二硫键相连;用制备性SDDS-PAGE法获得菜心GO同工酶的40kD亚基,并和菜心GO同工酶一起测定其氨基酸组成,该GO同工酶及40kD亚基的碱/酸性氨基酸的比例分别为0.66和0.54,表明40kD亚基可能是个酸性蛋白,而66kD带则是个碱性蛋白.SDS-PAGE、CE-SDS和氨基酸测定表明,和菠菜GO同工酶类似,菜心GO同工酶也可能含40kD酸性亚基和66kD碱性亚基.鉴于在醋酸薄膜电泳中菜心GO同工酶的pI>10.0,以及在IEF能聚焦在pI4.5的结果,表明菜心GO同工酶66kD碱性亚基的pI>10.0,而菜心GO同工酶40kD酸性亚基的pI<4.5.在电场中,非共价相连的GO同工酶两种亚基很容易分离,导致GO同工酶在IEF中出现近10种pI.
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