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雄性不育是导致柑橘无核的主要原因,无核育种是柑橘品质改良的重要内容,研究柑橘雄性不育及无核分子机理可以为柑橘无核育种提供理论基础。micro RNAs在植物生长发育过程中起着非常重要的调控作用。‘黔阳无核’椪柑是普通椪柑的无核芽变,具有雄性不育特征;‘华柚2号’是HB柚经原生质体融合转移了‘国庆一号’温州蜜柑线粒体基因组的雄性不育胞质杂种。本研究选用了这两个无核柑橘材料,分别以‘鄂柑一号’椪柑和HB柚为对照,利用高通量测序技术,发掘和鉴定出一系列可能与柑橘雄性不育性状相关的候选mi RNAs,并利用降解组测序在全基因组范围内鉴定mi RNAs的靶基因。此外,利用小RNA测序数据和在全基因组范围内鉴定出HB柚大量PHAS位点及phasi RNAs;利用柚降解组测序数据鉴定出一系列phasi RNAs的靶基因,构建了参与柑橘花发育的mi RNAs/phasi RNAs-PHAS-phasi RNAs-target调控网络,以揭示mi RNAs在柑橘花发育过程中的生物功能及其与柑橘雄性不育的关系。主要研究结果如下:1.小RNA测序及降解组测序鉴定椪柑及柚mi RNAs及其靶基因选择椪柑花药发育减数分裂四分体时期的花器官及成熟的花药两个时期,以HB柚及‘华柚2号’雄蕊原基开始发育至小孢子释放过程中花器官的三个时期,对其进行小RNA测序及降解组测序,在椪柑中共鉴定出属于32个mi RNA家族的156个known mi RNAs和24个novel mi RNAs,及138个靶基因;柚中鉴定出184个known mi RNAs和22个novel mi RNAs及86个靶基因。椪柑和柚mi RNAs的大部分靶基因是转录因子,包括ARF转录因子、AP2转录因子、SBP-box转录因子、MYB转录因子等。利用5’RACE技术,椪柑和柚中分别有5个和8个靶基因验证出其相应的剪切位点,与降解组分析结果一致。2.挖掘与柑橘雄性不育相关候选mi RNAs由小RNA测序丰度结果得到71个known mi RNAs及11个novel mi RNAs在两个椪柑材料中差异表达,42个known mi RNAs在柚两个材料中差异表达;利用q RT-PCR及Northern杂交技术对mi RNAs在花发育不同时期表达模式进行验证,包括mi R156、mi R167、mi R399、mi R397、mi R172、mi R827等,大部分mi RNAs表达结果与测序数据一致,靶基因定量结果表明大部分靶基因受到了其对应的mi RNAs的负调控,它们可以作为参与柑橘雄性不育的候选mi RNAs。在这些差异表达的mi RNAs中,mi R167和mi R399在两对材料中都显示出显著的表达差异;尤其在HB柚与‘华柚2号’胞质杂种中,这两个mi RNAs家族中的几乎每一个成员都显示出明显的下调表达,表明mi R167和mi R399可能在雄性器官发育中起重要作用。3.候选mi RNAs功能分析与验证酵母单杂交与双荧光素酶实验表明一个DREB转录因子可以与mi R167a启动子互作并抑制其转录活性。构建了mi R167a的超量表达载体分别转化了拟南芥和山金柑,拟南芥转基因植株花发育表现出明显的不育性状,花发育异常,花瓣闭合不开放,角果极短且无籽;构建了mi R156a超量表达载体和mi R399a靶基因mimic超量表达载体转化山金柑,目前mi R156a转化山金柑获得一棵阳性植株,目前已开花结果,由于阳性植株较少还不能确定表型;mi R399a靶基因mimic超量表达载体转基因山金柑获得27棵抗性苗,有17棵鉴定为阳性植株,花器官表型有待后期观察。4.HB柚与胞质杂种中phasi RNAs鉴定利用小RNA测序数据鉴定到280个PHAS位点,其中有157个来自基因间区域,143个PHAS位点属于编码基因;这些编码基因中有90个为抗病基因NB-LRR,12个为PPR基因,19个为长链非编码RNA,还有3个为转录因子,分别是NAC转录因子、ARF转录因子和MYB转录因子。有22个PHAS位点寻找到触发其产生phasi RNAs的12个mi RNAs,包括mi R167、mi R390、mi R3954、mi R396、mi R472、mi R482、mi R172等,有24个PHAS位点被19个phasi RNAs触发产生phasi RNAs,所有的PHAS位点共产生了2476个phasi RNAs;利用降解组数据总共鉴定到这些phasi RNAs的95个靶基因,这些靶基因参与了细胞碳水化合物代谢、芳香物质及脂质代谢、逆境响应及物质转运等过程。一个mi R390-TAS-phasi RNAs-ARF调控网络和一个由mi R472和其他phasi RNAs直接或间接触发PPR位点产生phasi RNAs的调控网络被构建出来。以上结果表明Mi RNA/phasi RNAs-PHAS-phasi RNAs-m RNA靶基因的调控网络可能参与柑橘雄性不育过程。