研究背景:骨肉瘤是最常见的骨恶性肿瘤,其发病人数大约占到所有骨恶性肿瘤的30%左右,尤其是小儿中发病率较高。骨肉瘤的十年生存率大约是60Y%到75%。目前对于骨肉瘤的治疗,一般是术前化疗,然后行局部广泛切除的保肢术或行截肢术,术后化疗。目前用于化疗的药物对于骨肉瘤细胞和人体正常细胞都有明显的杀伤作用,副作用较大,而这些较大的副作用也有可能进一步降低了骨肉瘤病人的生存率。因此,需要探索新的化疗药物,增加对骨肉瘤细胞的杀伤作用,同时降低对正常组织的损伤,从而进一步改善病人的预后。姜黄素是从植物中提取的一种天然的化学成分,在中国被作为一种中药来治疗多种疾病。目前的研究表明,姜黄素可抑制肝癌、胃癌、胰腺癌等恶性肿瘤;姜黄素可以通过作用于转录因子、凋亡基因、细胞信号分子等多种机制发挥抗肿瘤作用。姜黄素的药理作用广泛,毒性较低,在人体中的耐受性良好。p53基因是迄今发现与人类肿瘤相关性最高的基因,也是肿瘤细胞中最容易发生突变失活的基因。p53的正常功能是在G1期检查DNA损伤点,监视细胞基因的完整性。对于p53在姜黄素诱导的凋亡中所发挥的作用是有争议的,一些研究认为这些凋亡作用是p53依赖性的,而另一些研究认为在这些凋亡作用中正常功能的p53不是必须的,这些研究差异的产生可能是由于所研究的肿瘤类型及细胞系的不同。由于p53基因突变在骨肉瘤细胞中的发生率非常高,如果姜黄素的抗骨肉瘤作用是p53途径依赖性的,将会大大限制它作为一种抗骨肉瘤药物的使用。研究目的:研究姜黄素对骨肉瘤的作用规律,研究其作用的分子机制,并分析其作用是否为p53途径依赖性,对将来姜黄素的临床应用前景是非常重要的。本研究选择p53基因型不同的两种人骨肉瘤细胞系,即p53缺失型MG-63细胞系和p53野生型U2OS细胞系,通过研究不同浓度姜黄素对这两种细胞系的抑制作用,分析姜黄素对U2OS及MG-63的细胞增殖、细胞凋亡及侵袭作用的影响,研究姜黄素的抗骨肉瘤作用随其浓度及作用时间变化的规律,并研究其抗骨肉瘤作用的分子机制;研究这两种细胞系对姜黄素敏感性的差异,探讨姜黄素的抗骨肉瘤作用是否为p53依赖性。研究方法:第一部分:姜黄素对人骨肉瘤p53缺失型MG-63细胞系增殖、凋亡和侵袭的作用规律研究1.骨肉瘤p53缺失型MG-63细胞系购自中国科学院上海细胞库。2.MG-63细胞系分为4组,A组为空白对照组,加入PBS缓冲液;B组培养液中加入姜黄素,浓度调整为5μmol/L;C组培养液中加入姜黄素,浓度调整为10μmol/L;D组培养液中加入姜黄素,浓度调整为20μmol/L。3.细胞增殖能力检测。采用MTT法检测MG-63细胞的增殖能力。细胞增殖试验在96孔板中进行检测(1X104细胞/孔)。在加入不同浓度的姜黄素之后,MG-63细胞在5%二氧化碳,温度为37℃的环境中培养48小时或72小时。将10μl的5mg/ml的MTT溶液分别加入各孔中,继续在37℃的环境中将细胞培养4小时。向各孔中分别加入二甲基亚砜(DMSO),采用酶联免疫检测仪,在490nm波长处分别测量各孔的吸光值。4.细胞凋亡水平检测。将MG-63细胞系接种于12孔板(1.5×105/孔),分别加入浓度为0-20 μmol/L的姜黄素,培养24小时后收集各组细胞。采用凋亡检测试剂盒(eBioscience,San Diego,CA,USA)进行检测。悬浮于缓冲液中的细胞,加入Annexin V-FITC和PI后置于室温避光处反应15分钟。通过FACSCalibur细胞分析仪进行分析。Annexin V阳性的细胞为凋亡细胞。5.肿瘤细胞侵袭能力检测。无血清DMEM培养基按1:19稀释Matrigel,50μl铺于transwell小室。1X 105的MG-63细胞,分别加入不同浓度的姜黄素培养48小时,下室加入含10%胎牛血清的DMEM培养基。培养48小时后,去除上室的Matrigel;细胞采用甲醇固定,结晶紫染色;显微镜下观察,拍照,计数。6.统计学分析。所有数据均以至少三次独立实验的平均数士标准差(Mean土SD)表示。对于两组数据的统计学分析采用配对t检验(paired Student’ s t-test),多于两组数据的统计学分析采用单因素方差分析(one-way analysis of variance)。差异有统计学意义定义为*<0.05,**P<0.01。第二部分:姜黄素诱导人骨肉瘤p53缺失型MG-63细胞系凋亡的分子机制研究Western Blot检测凋亡相关蛋白的表达。MG-63细胞系各组分别加入浓度为0-20 μmol/L的姜黄素,Western Blot法检测凋亡相关蛋白的表达。一抗分别针对 Bcl-2,Bax,cleaved PARP,Caspase-3,和β-actin。12 小时后收集处理后的细胞,用预冷的4℃的PBS缓冲液(pH 7.4)洗两次,然后加入蛋白裂解液,置于冰上半小时。裂解产物于4℃下12000rpmm离心,进行蛋白质浓度测定。SDS-PAGE电泳分离样品。分离后的蛋白被转移到PVDF膜。分别采用一抗和二抗处理。采用odyssey红外成像系统进行探测。β-actin作为内参。第三部分:姜黄素对人骨肉瘤p53缺失型MG-63细胞系及p53野生型U20S细胞系增殖、凋亡及侵袭影响的比较分析1.骨肉瘤p53缺失型MG-63细胞系和p53野生型U20S细胞系均购自中国科学院上海细胞库。2.U20S细胞系分为4组,A组为空白对照组,加入PBS缓冲液;B组培养液中加入姜黄素,浓度为5分mol/L;C组培养液中加入姜黄素,浓度调整为10μmol/L;D组培养液中加入姜黄素,浓度调整为20μmol/L。MG-63细胞系分组同前。3.细胞增殖能力检测。采用MTT法检测MG-63细胞及U20S细胞的增殖能力。细胞增殖试验在96孔板中进行检测(1X104细胞/孔)。在加入不同浓度的姜黄素之后,MG-63细胞及U2OS细胞在5%二氧化碳,温度为37℃的环境中培养48小时或72小时。将10μl的5mg/ml的MTT溶液分别加入各孔中,继续在37℃的环境中将细胞培养4小时。向各孔中分别加入二甲基亚砜(DMSO),采用酶联免疫检测仪,在490nm波长处分别测量各孔的吸光值。4.细胞凋亡水平检测。将MG-63、U2OS这两种p53基因型不同的细胞分别接种于12孔板(1.5×105/孔),分别加入浓度为0-20 μmol/L的姜黄素,培养24小时后收集各组细胞。采用凋亡检测试剂盒(eBioscience,SanDiego,CA,USA)进行检测。悬浮于缓冲液中的细胞,加入AnnexinV-FITC和PI后置于室温避光处反应15分钟。通过FACSCalibur细胞分析仪进行分析。Annexin V阳性的细胞为凋亡细胞。5.肿瘤细胞侵袭能力检测。无血清DMEM培养基按1:19稀释Matrigel,50μl铺于transwell小室。1×103的MG-63细胞及U20S细胞,分别加入不同浓度的姜黄素培养48小时,下室加入含10%胎牛血清的DMEM培养基。培养48小时后,去除上室的Matrigel;细胞采用甲醇固定,结晶紫染色;显微镜下观察,拍照,计数。6.统计学分析。所有数据均以至少三次独立实验的平均数土标准差(Mean±SD)表示。对于两组数据的统计学分析采用配对t检验(paired Student’ s t-test),多于两组数据的统计学分析采用单因素方差分析(one-way analysis of variance)。差异有统计学意义定义为*P<0.05,**P<0.01。研究结果:第一部分:姜黄素对人骨肉瘤p53缺失型MG-63细胞系增殖、凋亡和侵袭的作用规律研究1.MTT法检测不同浓度姜黄素及不同作用时间对人骨肉瘤MG-63细胞系增殖的影响。为了探讨姜黄素对人骨肉瘤细胞系MG-63(p53缺失型)增殖的影响,MG-63细胞在不同姜黄素浓度下培养48h和72h。实验结果显示,随着姜黄素浓度的增高,MG-63细胞的增殖受到明显抑制,其受到抑制的程度与姜黄素浓度呈现依赖关系。另外,本实验也研究了骨肉瘤细胞增殖与姜黄素作用时间的关系,结果显示姜黄素作用时间的长短对骨肉瘤细胞受抑制的程度也有明显的相关性。姜黄素作用72小时组,骨肉瘤细胞受抑制的程度显著高于48小时组,其差别有统计学意义。由上可见,在0-20μmol/L的范围内,姜黄素的浓度越高,作用的时间越长,骨肉瘤增殖受抑制的程度也越高。2.姜黄素能够增强人骨肉瘤细胞MG-63的凋亡水平研究表明,姜黄素不仅能够抑制肿瘤细胞的增殖,而且能够促进肿瘤细胞的凋亡。为了验证姜黄素对骨肉瘤细胞系的促凋亡作用,将浓度为5,10,20μmol/L的姜黄素作用24h后,通过流式细胞术检测p53缺失型MG-63细胞系的凋亡水平。结果显示,随着姜黄素浓度的增高,MG-63细胞的凋亡率明显增高,增高的程度与姜黄素的浓度呈正比。由上可见,在0-20μmol/L的范围内,姜黄素的浓度越高,MG-63细胞系的凋亡率越高。3.不同浓度姜黄素对人骨肉瘤细胞系MG-63侵袭能力的影响有研究报道,姜黄素不仅能够通过诱导凋亡,抑制肿瘤细胞的增殖,还能够降低肿瘤的侵袭能力。为了进一步验证姜黄素对骨肉瘤侵袭的抑制作用,我们采用Transwell细胞体外侵袭实验分别对姜黄素抑制MG-63侵袭能力进行了研究。结果显示,随着姜黄素浓度的提高,MG-63细胞系的侵袭能力都有了显著的下降。第二部分:姜黄素诱导人骨肉瘤p53缺失型MG-63细胞系凋亡的分子机制研究为了进一步探讨在p53缺失型MG-63细胞系中,姜黄素促进凋亡的具体分子机制,我们以Western Blot法检测MG-63细胞中抗凋亡基因Bcl-2和凋亡基因Bax,以及caspase级联反应蛋白Caspase-3、cleaved PARP,在不同浓度的姜黄素作用之后的表达水平。检测发现,Bcl-2蛋白的表达量随着姜黄素浓度的增高而明显降低,呈剂量依赖性,Bax、Caspase-3、cleaved PARP等蛋白的表达量都随着姜黄素浓度的增高而逐渐增高,并呈剂量依赖性。同时,Bax/Bcl-2的比例随着姜黄素浓度的增高而显著增高。由上可见,姜黄素对骨肉瘤细胞多种促凋亡蛋白的表达具有上调作用,并对抗凋亡蛋白的表达具有抑制作用。姜黄素通过上调Bax/Bcl-2的比例并激活Caspase-3来促进骨肉瘤细胞的凋亡。这表明,姜黄素促进人骨肉瘤MG-63细胞系的凋亡作用的分子机制与线粒体通路有关。第三部分:姜黄素对人骨肉瘤p53缺失型MG-63细胞系及p53野生型U20S细胞系增殖、凋亡及侵袭影响的比较分析1.MTT法检测不同浓度姜黄素对人骨肉瘤细胞MG-63和U20S增殖的影响。为了探讨姜黄素对不同p53基因型骨肉瘤细胞系MG-63(P53缺失型)和U20S(P53野生型)增殖的影响,MG-63、U20S细胞在不同姜黄素浓度下培养48h和72h。实验结果显示,随着姜黄素浓度的增高,MG-63和U20S细胞的增殖都受到明显抑制,其受到抑制的程度与姜黄素浓度都呈现依赖关系。另外,在这两种细胞系中,姜黄素作用72小时组,骨肉瘤细胞受抑制的程度都显著高于48小时组。p53缺失型MG-63细胞系比p53野生型U20S细胞系对姜黄素更敏感,在作用时间相同,姜黄素浓度相同的情况下,MG-63细胞系和U20S细胞系都受到明显的抑制,但是MG-63细胞系受抑制的程度更高。在20μmol/L的姜黄素作用72小时的情况下,MG-63受抑制的程度可达到80%左右。根据本实验,p53缺失型MG-63细胞系比p53野生型U20S细胞系对姜黄素更敏感,在相同情况下,其增殖受抑制的程度更高。这个结果表明,姜黄素抑制骨肉瘤细胞增殖的作用是p53非依赖性的。2.姜黄素能够增强骨肉瘤细胞MG-63和U20S的凋亡水平为了验证姜黄素对骨肉瘤细胞系的促凋亡作用,将浓度为5,10,20μnol/L的姜黄素作用24h后,通过流式细胞术检测p53缺失型MG-63细胞系和p53野生型U2OS细胞系的凋亡水平。结果显示,随着姜黄素浓度的增高,MG-63细胞和U20S细胞的凋亡率都明显增高,增高的程度与姜黄素的浓度都呈正比。在姜黄素浓度相同的情况下,P53缺失型MG-63细胞系比p53野生型U20S细胞系凋亡率更高,尤其是在姜黄素20lμol/L的情况下,MG-63细胞系的凋亡率大约为84.21%,高于U20S细胞系的42.81%。由上可见,p53缺失型MG-63细胞系比p53野生型U20S细胞系对姜黄素更敏感,相同姜黄素浓度情况下,MG-63细胞系的凋亡率更高。这个结果表明,姜黄素诱导骨肉瘤细胞凋亡的作用是p53非依赖性的。3.不同浓度姜黄素对骨肉瘤细胞MG-63和U20S侵袭能力的影响为了进一步验证姜黄素对骨肉瘤侵袭的抑制作用,我们采用Transwell细胞体外侵袭实验分别对姜黄素抑制MG-63和U20S侵袭能力进行了研究。结果显示,随着姜黄素浓度的提高,MG-63细胞系与U20S细胞系的侵袭能力都有了显著的下降。与细胞增殖和凋亡的情况类似,在肿瘤侵袭实验中,p53缺失型MG-63细胞系比p53野生型U20S细胞系对姜黄素更敏感。相同姜黄素浓度情况下,MG-63细胞侵袭能力下降的程度更多。这个结果表明,姜黄素对骨肉瘤细胞侵袭能力的抑制也是p53非依赖性的。结论:随着姜黄素浓度的升高,人骨肉瘤MG-63和U20S细胞系的增殖受到明显的抑制,凋亡水平明显增高,侵袭能力逐渐降低;且在一定范围内,骨肉瘤细胞系受到抑制的程度与姜黄素的浓度及作用时间呈现依赖关系。无论是细胞增殖能力、凋亡水平还是细胞侵袭能力,在相同条件下,P53缺失型MG-63细胞系均比P53野生型U20S细胞系对姜黄素更为敏感。这表明,姜黄素的抗骨肉瘤作用是通过p53非依赖性途径实现的。为了进一步探讨姜黄素通过p53非依赖性途径促进骨肉瘤细胞凋亡的具体分子机制,进行了 WesternBlot检测,结果表明,随着姜黄素浓度的增高,Bax的表达量明显增高,而Bcl-2的表达量逐渐降低,Bax/Bcl-2的比例随着姜黄素的浓度的增高而成比例的增高;随着姜黄素浓度的升高,cleaved PARP和Caspase-3的表达量也都显著增高。综上,姜黄素可以通过线粒体通路发挥抗骨肉瘤作用,通过升高Bax/Bcl-2的比例并激活Caspase-3来诱导骨肉瘤细胞凋亡,这种作用为p53非依赖性。姜黄素作为传统化疗方案的重要辅助和补充,在国内外受到广泛的关注和研究。p53突变在恶性肿瘤中大量存在,而p53突变将会导致肿瘤对化疗产生广泛耐药性;姜黄素对骨肉瘤的p53非依赖性的细胞毒性作用,提示姜黄素对那些因为P53表达或功能异常而对传统化疗方案产生耐药性的肿瘤,可能具有良好的治疗效果。