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目的：观察氨基甾体H42648对人慢性粒细胞白血病K562细胞系的抑制增殖和诱导分化作用，并进一步探讨其作用机制。
方法：采用液体培养实验，MTT实验，集落培养实验观察H42648对K562细胞增殖能力的影响；采用Wright-Giemsa染色，联苯胺染色和流式细胞术观察K562细胞功能变化，评价}142648对K562细胞的诱导分化作用。采用基因芯片、实时荧光定量RT-PCR检测氨基甾体H42648作用3d后对人K562白血病细胞基因表达的影响；通过荧光分光光度计、原子吸收光谱检测H42648作用于K562细胞30min后细胞内钙离子浓度的变化；采用液体培养实验、Wright-Giemsa染色和流式细胞术观察钙通道阻断剂verapamil、gabapentin和钙通道激活剂praziquantel对K562细胞增殖和分化的影响。
结果：
1．氨基甾体H42648对K562细胞增殖的影响
在连续培养的1～5d，不同浓度的H42648(10<-9>～10<-5>mol/L)可以抑制K562细胞增殖。经10<-6>mol/L H42648培养5d，液体培养实验和MTT 实验显示：K562细胞生长抑制率分别是(52.44±2.05)[％]和(43.26±2.54)[％]；8d集落培养显示：10<-6>mol/L H42648作用下K562细胞生长抑制率为(48.71+8.24)[％]。且这种抑制作用呈一定的剂量依赖关系。
2．氨基甾体H42648对K562细胞分化的影响
K562细胞培养5d后，Wright-Giemsa染色，光镜下可见与对照组比较，经H42648处理后的细胞体积变大，核浆比例减少，表现一定程度的分化。细胞内血红蛋白联苯胺染色显示，10<-6>mol/L H42648作用5d后，K562细胞联苯胺染色A值为(O.202±0.009)，较对照组(0.085±0.009、)显著升高(P<0.05)。流式细胞仪分析显示，10<-6>mol/LH42648作用于K562细胞4d后，细胞膜上CD71表面标记表达阳性率为89.91[％]。
3．氨基甾体H42648抑制K562细胞的增殖和诱导其分化作用的机制研究
(1)基因芯片检测氨基甾体H42628对K562细胞基因表达的影响
本实验采用深圳微芯生物科技有限公司的生物芯片检测氨基甾体H42648作用K562细胞3d后的基因表达差异。分别提取对照组(无水乙醇处理)和实验组(10<-6>mol／L H42648处理)细胞的mRNA，反转录成cDNA，分别标记两种不同颜色的荧光Cy5和Cy3，等量混合后与芯片进行杂交反应。对于芯片上各点都采用Cy5／Cy3的比值作为ratio值，ratio值大于2.0或者小于O.5的点被认为是有表达差异的基因。其中钙通道蛋白基因(CACNA2D1)的ratio=2.66， 即与对照组比较该基因表达上调。
(2)Real-time PCR检测氨基甾体H42648作用后K562细胞钙通道蛋白mRNA的表达量变化分别提取对照组(无水乙醇处理)和试验组(10<-6>mol／L H42648处理)细胞的mRNA，反转录成cDNA，使用双标准曲线法进行相对定量。最终得到钙通道蛋白基因在对照组和试验组的相对含量(以内参校正后得值)分别是：1.99x10<-3>和5.30x10<-3>，试验组／对照组=2.66，即H42648处理组钙通道蛋白mRNA的表达上调，与基因芯片的结果一致。
(3)氨基甾体H42648对K562细胞内[Ca<2+>]的影响
用Fura—2／AM负载K562细胞，经10<-6>mol／L H42648处理30min后，其A值为(132.067±10.745)，与对照组(168.467±1.802)比较显著下降(P亚基阻断剂，其作用于K562细胞5d，可见不同浓度的verapamil(10<-8>10<-4>mol／L)可以抑制K562细胞生长，并呈剂量依赖性。10<-4>mol／L的verapamil作用于K562细胞5d，细胞生长抑制率为(91.78±7.47)％。钙通道阻断剂gabapentin是钙通道蛋白α<,2>δ<,1>亚基阻断剂，连续培养5d，可见不同浓度的gabapentin(10<-8>～10<-4>mol／L)对K562细胞的增殖无明显抑制作用，与对照组比较P>0.05，无统计学意义。praziquantel是钙通道蛋白β亚基激活剂，连续培养5d，可见K562细胞的生长受到抑制，10<-4>mol／L的praziquantel作用于K562细胞5d，细胞生长抑制率为(54.79±13.09)％。
(5)钙通道阻断剂和激活剂对K562细胞分化的影响
不同浓度的verapamil、gabapentin和praziquantel作用于K562细胞连续培养5d，涂片，Wright—Giemsa染色，光镜下可见与对照组比较经verapamil处理的K562细胞，大多数细胞核固缩，可见典型的凋亡小体，经gabapentin和praziquantel处理的K562细胞，细胞体积变大，核浆比例减少，表现一定程度的分化。流式细胞仪分析显示，10<-6>mol／L verapamil、gabapentin和praziquantel作用于K562细胞4d后，细胞膜上CD71表面标记表达阳性率分别为87.89％、82.49％、85.14％。
(6)H42648、verapamil、gabapentin和praziquantel对K562细胞周期的影响流式细胞仪分析显示，10<-6>mol／L H42648、verapamil、gabapentin和praziquantel分别作用于K562细胞4d后，对照组与10<-6>mol／LH42648、verapamil、gabapentin处理组处于G1期的细胞分别为39.7％、41.1％、39.9％和40.7％，处于S期的细胞分别为52.7％、55.2％、55.3％和54.9％，处于G2期的细胞分别为7.6％、3.7％、4.8％和4.4％。与对照组比较，处理组分布于各期的细胞变化并不明显。10<-6>mol／Lpraziquantel作用于K562细胞4d后，对照组与处理组处于G1期的细胞分别为39.7％和20.7％，处于S期的细胞分别为52.7％和74.7％，处于G2期的细胞分别为7.6％和4.6％。处理组较对照组分布于S期的细胞明显增加，分布于G1期和G2期的细胞则减少，呈现S期阻滞。
结论：
1．氨基甾体H42648能显著抑制K562细胞的增殖，并呈一定的剂量依赖关系。
2．氨基甾体H42648具有诱导K562细胞向红系分化的作用。
3．氨基甾体H42648可以诱导K562细胞钙通道蛋白基因 (CACNA2D1)表达上调。
4．氨基甾体H42648作用K562细胞30min，可导致细胞内游离钙和总钙含量下降。
5．钙通道蛋白α<,1>亚基阻断剂verapamil可显著抑制K562细胞增殖并诱导其向红系分化。钙通道蛋白α<,2>δ<,1>亚基阻断剂gabapentin，可以诱导K562细胞向红系分化，但其抑制增殖作用不明显。praziquantel是钙通道蛋白β亚基激活剂，它在抑制K562细胞增殖同时又诱导其向红系分化。这三者对K562细胞的作用与氨基甾体H42648极为相似，因此，H42648很可能是通过影响钙通道的不同亚单位从而抑制K562细胞增殖并诱导其分化的。