冠脉转染Nrf2基因对大鼠缺血再灌注心肌的保护作用及机制的研究

来源 :中南大学 | 被引量 : 2次 | 上传用户:phpzen
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目的:(1).构建携带人Nrf2基因的腺病毒载体;(2).研究冠脉途径腺病毒载体转染Nrf2基因到心肌的可行性,如果可行观察其对缺血再灌注心肌的影响;(3).研究Nrf2基因保护缺血再灌注心肌的可能机制。方法:(1).构建包含Nrf2的重组腺病毒:采用分子克隆手段获得携带增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因的重组质粒、携带Nrf2的重组质粒,以细胞内同源重组法构建重组腺病毒Adv-EGFP、Adv-Nrf2,在293细胞内分别扩增,按Adeno-XTM Virus Purification Kit (BD Biosciences, Clontech)的步骤纯化病毒。经纯化的病毒滴度分别为,Adv-EGFP:1X1012(PFU/mL)、Adv-Nrf2:1X1012(PFU/mL)。根据预实验结果,确定实验使用最佳Adv-EGFP、Adv-Nrf2滴度为1×109(PFU/ml),用量为0.1ml。(2).40只SD大鼠随机分成4组(n=10)。大鼠左侧开胸,暴露心尖部及主、肺动脉根部,用10号线于主、肺动脉根部阻断循环,同时用27号针头于心尖部注入0.1 ml各组相应试剂至左心室腔,使之在密闭的冠脉循环内分布,10秒后松开10号线。其中第Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组注射0.1ml空病毒载体;第Ⅳ注射0.1ml含Adv-Nrf2的重组腺病毒。关胸苏醒后,稳定3天,使经冠脉转染的基因充分表达于心肌。(3).冠脉转染3天后,再次暴露胸腔,在左心耳与肺动脉圆锥之间结扎心大静脉及冠状动脉左前降支(LAD)。结扎30min后,松开缝线使冠状动脉再通120min。Ⅰ组只穿线不结扎。Ⅲ组在LAD结扎5min后开放5min,并重复3次,然后再行30min缺血、120min再灌注。(4).采用BL-420F系统全程监测所有动物心电活动及平均动脉压;采用Evan’s Blue和TTC双染色法测定心肌梗死面积;光学显微镜下观察心肌的炎症改变;电镜下观察心肌超微结构的改变;硫代巴比妥酸法测定心肌组织MDA的含量;黄嘿吟氧化酶原理测定心肌组织SOD活性;酶联免疫吸附试验测定心肌组织TNF-a的含量;Western Blotting免疫印迹测定Bcl-2及Bax蛋白表达的改变;原位末端标记法(TUNEL)检测心肌细胞凋亡等。结果:(1).HR、MAP、(?)心律失常及心肌梗死面积的观察:各组大鼠HR、MAP在基础状态时无明显差异;缺血再灌注后后,HR在T3、T5、T6时下降较明显(P<0.05);MAP则在T1、T3、T4、T5、T6时下降较明显(P<0.05);各组心律失常发生率均明显增高(P<0.05);而Ⅲ组、Ⅳ组HR、MAP及心律失常发生率明显好于Ⅱ组。Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ组心肌梗死面积分别为(37.6±1.9)%、(26±1.5)%、(26.6±1.0)%。与Ⅱ组比较,Ⅲ、Ⅳ组能明显的降低心肌梗死面积(P<0.05)。(2).心肌酶学与肌钙蛋白的观察:I/R后,各组LDH、CK、CK-MB、cTnl均明显升高(P<0.05),Ⅲ、Ⅳ组与Ⅱ组比有统计学意义(P<0.05);Ⅳ组CK、CK-MB比Ⅲ组升高更为明显(P<0.05)。(3).光镜及电镜观察:光镜下Ⅱ组呈现心肌损伤病理改变,可见细胞水肿、排列紊乱、心肌纤维断裂、大量红细胞及中性粒细胞浸润等;而Ⅲ、Ⅳ组病理损伤程度较Ⅱ组明显减轻。电镜下Ⅱ组损伤最严重,可见心肌水肿明显,心肌纤维排列紊乱,部分有断裂和溶解,明暗带不清,线粒体肿胀,部分嵴断裂溶解,并有广泛空泡样变性等,而Ⅲ、Ⅳ组亚细胞结构损伤较Ⅱ组明显减轻。(4).氧化损伤程度及炎性细胞因子的观察:I/R后,各组MDA、TNF-a均明显升高(P<0.05),Ⅲ、Ⅳ组与Ⅱ组相比有统计学意义(P<0.05)。缺血再灌注后,各组SOD明显降低(P<0.05),Ⅲ、Ⅳ组与Ⅱ组相比有统计学意义(P<0.05)。(5).心肌表达的蛋白及细胞凋亡的观察:缺血再灌注后,各组Bcl-2/Bax比值均明显降低(P<0.05),Ⅲ、Ⅳ组与Ⅱ组比有统计学意义(P<0.05)。I/R后,各组大鼠心肌细胞凋亡均明显增多(P<0.05),Ⅲ、Ⅳ组与Ⅱ组比有统计学意义(P<0.05)。结论:(1).成功构建了Adv-EGFP和Adv-Nrf2,为进一步研究其功能奠定了基础;(2).Nrf2基因能通过冠脉途径转染至大鼠心肌,过表达Nrf2基因对缺血再灌注心肌具有明显的保护作用;(3).过表达Nrf2通过激活Nrf2-Keap1-ARE信号通路,通过增强抗氧化应激、抗炎及抑制心肌细胞凋亡保护缺血再灌注心肌;(4).Nrf2组与缺血预处理组大部分指标没有统计学差异,可以起到与缺血预处理类似的保护作用。
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