原生动物纤毛虫是一类高度细胞分化的真核单细胞动物。许多种类的纤毛虫遇到逆境时都会形成休眠包囊。这些能够形成包囊的纤毛虫已成为探索真核细胞结构和功能调控机理的重要模式动物。因纤毛虫形成休眠包囊是一个受基因精细调控的复杂过程,故相应基因的选择性表达是导致其细胞形态结构和生理生化变化的分子机制。本研究在先前研究基础上,以易培养、易诱导包囊形成的冠突尾伪柱虫(Pseudourostyla cristata)为实验材料,应用转录组学(RNA-seq)技术、RNAi技术、qRT-PCR技术和生物信息学等现代生物技术,系统地比较分析纤毛虫包囊形成前后相关基因的变化,从中发现纤毛虫包囊形成的相关信号通路和差异表达基因,即采用转录组学辅以多种现代分子生物学技术从整体水平上探索纤毛虫形成包囊的分子机制,揭示纤毛虫包囊形成的分子本质。取得的主要结果如下:(1)冠突伪尾柱虫营养细胞和包囊转录组文库的构建和测序分析利用Illumina HiSeqTM4000测序平台对冠突伪尾柱虫转录组进行高通量测序,经过拼接共获得了 Unigene41,965,669条,有2,582条差异Unigene,与营养细胞相比,包囊细胞上调的Unigene 316 条,下调的 Unigene 2,266 条。将所有的 Unigene 进行注释,有 36,934,220 条 Unigene得到注释,差异Unigene注释到2,519个GO条目中,其中相比于营养细胞,包囊细胞上调的Unigene注释到430个GO条目,下调的Unigene注释到2,317个GO条目。这些差异条目主要涉及包囊壁合成、细胞内物质运输、核糖体有关细胞器等;这些差异基因共映射到284个不同的通路中,与营养细胞相比包囊细胞上调的Unigene映射到73条pathway,下调的Unigene映射到279条pathway。选取差异显著的一些信号通路如:钙离子信号通路、蛋白降解信号通路及MAPK信号传导通路,并找出这些通路中的一些重要差异基因进行分析,与营养细胞相比,发现在钙离子运输信号通路的24个差异基因中,包囊细胞有23个差异基因下调,1个差异基因上调;在依赖泛素降解信号通路的18个差异基因中,包囊细胞有16个差异基因下调,2个差异基因上调;在MAPK信号通路的17个差异基因中,包囊细胞有16个差异基因下调,1个差异基因上调。上述三条信号通路中的差异基因绝大多数表达下调,所以这三条通路信号效应减弱。了解和分析这些信号通路及其相关差异表达基因,有助于探究其在冠突伪尾柱虫包囊形成时所发挥的作用,这也为其他纤毛类尾柱虫包囊形成相关蛋白和其他活性因子的筛选、研究提供重要的参考资料。(2)Hsp70 shRNA的构建及对冠突伪尾柱虫的Hsp70基因干扰效果的鉴定利用RNA干扰技术,以pHBAd-U6-CMV载体为基本骨架,构建了 基因干扰的3种表达载体。用喂食法将含有表达载体的菌株转进冠突伪尾柱虫营养细胞中,通过检测Hsp70基因的相对表达量,捡验所构建的Hsp70 shRNA干扰菌株沉默冠突伪尾柱虫Hsp70基因的效率。结果发现,Hsp70 shRNA干扰后的营养细胞中,Hsp70基因的表达都被敲低,其中在Hsp70 shRNA2干扰后的营养细胞中,Hsp70基因表达下调最为显著,并且在第5天时Hsp70基因的相对表达量下降最为明显,故选取第5天的Hsp70 shRNA2干扰的冠突伪尾柱虫营养细胞继续下面实验。另外发现,Hsp70 shRNA2干扰5天后,在对冠突伪尾柱虫继续进行干扰时,营养细胞部分形成包囊细胞,但这些包囊细胞生命力弱。(3)基于转录组技术比较分析沉默Hsp70基因对冠突伪尾柱虫包囊形成的影响分别以Hsp70 shRNA2干扰5天后的营养细胞与未干扰的营养细胞为实验组和对照组,进行转录组学比较分析,获得了 Unigene 33,354条,差异Unigene 2,001条,相比于对照组,实验组上调的Unigene 1,022条,下调的Unigene 979条。将所有的Unigene进行注释,有20,562条Unigene得到注释,差异Unigene注释到2,081个GO条目中,其中相比于对照组,实验组上调的Unigene注释到1,026个GO条目,下调的Unigene注释到1,484个GO条目。这些差异条目中,与DNA修复、结合、大小核形成相关条目增强,蛋白翻译、核糖体大小亚基形成、核糖体结构相关条目减弱。这些差异基因共映射到267个不同的通路中,与对照组相比实验组上调的Unigene映射到185条pathway,下调的Unigene映射到254条pathway。选取差异显著的一些信号通路如:JNK信号通路、自噬通路作和内吞信号通路。与对照组相比,进一步分析发现在JNK通路的12个差异基因中,实验组的这12个差异基因的相对表达量全部上调,这些差异基因的变化导致实验组中JNK通路的增强;在自噬通路的36个差异基因中,实验组17个差异基因的相对表达量上调,19个差异基因的相对表达量下调,这些差异基因的变化导致实验组中自噬通路的变化;内吞通路的10个差异基因中,实验组3个差异基因的相对表达量上调,7个差异基因的相对表达量下调,这些差异基因的变化导致实验组中致内吞信号通路的变化。(4)比较转录组技术分析Hsp70 shRNA2干扰后的冠突伪尾柱虫营养细胞与Hsp70 shRNA2干扰后的冠突伪尾柱虫包囊细胞为进一步研究Hsp70基因对冠突伪尾柱虫包囊形成的影响,应用比较转录组学技术分析实验组Hsp70 shRNA2干扰后的冠突伪尾柱虫包囊细胞与对照组Hsp70 shRNA2干扰后的冠突伪尾柱虫营养细胞基因表达的差异,获得了 Unigene 35,068条,差异Unigene 1,730条,相比于对照组,实验组上调的Unigene 1,188条,下调的Unigene 542条。将所有的Unigene进行注释,有22,374条Unigene得到注释,差异Unigene注释到1,665个GO条目中,其中相比于对照组,实验组上调的Unigene注释到1,302个GO条目,下调的Unigene注释到624个GO条目。进一步分析发现,在这些差异的条目中,蛋白翻译、胞间连丝等相关条目受到抑制,而与染色体浓缩、转录、核糖体结构相关条目增强。对这些Unigene的功能进行注释,得到260个差异的信号通路,与对照组相比实验组上调的Unigene映射到241条pathway,下调的Unigene映射到165条pathway。选取差异显著的信号通路如:P53通路、蛋白降解及消化通路和NF-kappa B信号通路。进一步分析发现,在P53通路的8个差异基因中,与对照组相比这8个差异基因在实验组中全部上调,这些差异基因的变化导致实验组中P53通路的增强;在蛋白降解及消化通路的4个差异基因中,与对照组相比,实验组有1个差异基因上调,3个差异基因下调,这些差异基因的变化导致实验组中蛋白降解及消化通路的减弱;在NF-kappa B信号通路的4个差异基因中,与对照组相比这4个差异基因在实验组中全部上调,这些差异基因的变化导致实验组中NF-kappa B通路的增强。这些信号通路及相关基因的变化影响了 Hsp70 shRNA2干扰后的冠突伪尾柱虫包囊细胞的生存能力。利用Q-PCR验证转录组测序数据,结果显示高度的一致性。本研究从比较转录组水平探索冠突伪尾柱虫休眠现象相关的多种信号通路和相关基因,为揭示纤毛虫包囊形成的内在调控机制、阐明真核细胞与环境相互作用关系和揭示真核细胞抵抗逆境的机理提供重要资料。