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背景和目的上皮滤泡细胞来源的甲状腺癌是全球内分泌系统最常见的恶性肿瘤之一,近年来发病率急剧上升。国际范围内,甲状腺癌是韩国女性最常见的癌症,美国女性第五常见的癌症。分化型甲状腺癌包括甲状腺乳头状癌和甲状腺滤泡状癌,虽然死亡率较低,但其复发率较高,在某些亚型患者中复发率达20-30%,甚至更高。尽管PTC的发病率和复发率很高,但大多数患者在经过手术加放射性碘和定期复查等标准治疗后预后良好。然而,手术无效和放射性碘难治的PTC仍然是导致甲状腺癌相关死亡的重要原因,并且目前没有有效的治疗方案。人们普遍认为,自噬和代谢系统通过细胞内蛋白质的分解及再分布来帮助肿瘤细胞存活。在我们之前的研究中,我们通过PCR发现PTC组织中p62的表达高于正常甲状腺组织。因此,我们认为p62在PTC中占有重要的地位,并通过调控PTC细胞的生长,实现细胞内稳态的精确调节。Sequestosome 1基因(SQSTM1)也被称为p62,位于5q35,是泛素化系统中的一个适配蛋白,也是选择性自噬中的一个货车蛋白,在调节细胞内蛋白降解中发挥重要作用。但也有报道指出,p62还参与了细胞周期、细胞代谢、硒对过氧自由基的清除作用等多种细胞生物学活动。p62基因突变与骨Paget病、小鼠髓系白血病进展、神经退行性疾病、肥胖、血管衰老、衰老病理和癌症密切相关。p62由440个氨基酸组成,覆盖10多个结构域和结合位点,是调节胰岛素信号、能量平衡、脂肪生成、BAT产热、炎症、氧化应激、凋亡等多种细胞活动的关键中心。越来越多的证据表明,p62参与多种信号转导途径,包括胰岛素信号转导途径、Keap1-Nrf2途径、ERK途径、p38/MAPK信号转导途径,证实p62对细胞具有重要的调节作用。因此,我们从多个方面探讨了p62对PTC细胞生理和功能的影响,并进一步研究PTC的发病机制。材料与方法1.收集经临床手术切除的甲状腺肿瘤组织及正常组织标本105例。通过RT-q PCR法检测p62基因在肿瘤及正常组织中的表达情况,并应用统计学知识分析临床病理特征。2.收集正常甲状腺细胞系Nthy-ori 3-1和甲状腺乳头状癌细胞系TPC-1提蛋白,通过Western Blot实验检测细胞水平p62蛋白的表达情况。3.通过CRISPR/Cas9基因编辑技术敲除TPC-1细胞株的p62基因片段,构建稳定传代细胞系p62-KO-TPC-1,通过RT-q PCR和Western Blot实验验证其敲除效率。4.通过CCK-8实验、集落形成实验、流式细胞术测细胞周期以及RT-q PCR测增殖相关基因在TPC-1和p62-KO-TPC-1细胞中的表达情况评估p62对肿瘤细胞增殖能力的影响;通过transwell实验检测p62对肿瘤细胞侵袭迁移能力的影响;通过流式细胞术检测细胞凋亡率,并通过Western Blot检测凋亡相关蛋白bax、bcl-2在TPC-1和p62-KO-TPC-1中的表达情况,评估p62对肿瘤细胞凋亡能力的影响。5.构建裸鼠荷瘤模型。实验组细胞株(p62-KO-TPC-1)、空白对照细胞株(TPC-1)接种2组各7只BALB/c雌性裸鼠,观察小鼠行为变化,定期测量小鼠体重和瘤体体积,至接种第20天处死裸鼠,剥取瘤体称重,根据瘤体重量、体积生长变化情况做点图和线图,分析计算抑瘤率,评估两组细胞株在小鼠体内成瘤结果的差异。6.将剥离的裸鼠瘤体进行免疫组化染色(Immunohistochemistry,IHC)和苏木精-伊红染色(hematoxylin-eosin staining,HE),检测p62、PCNA、PTEN、P53的表达,并用Image J软件分析差异。7.收集TPC-1和p62-KO-TPC-1细胞提蛋白,通过Western Blot检测增殖凋亡侵袭迁移相关通路蛋白的表达情况,探讨p62对TPC-1细胞的作用机制。8.采用SPSS 21.0统计学软件分析数据。结果1.105例PTC组织中p62蛋白表达率为69.5%(73/105),差异具有统计学意义(P﹤0.05);p62的表达情况与肿瘤大小相关(P=0.0066),但是,p62基因的表达情况与患者的年龄、性别、TNM分期以及淋巴结转移无统计学关系(P>0.05)。2.相较正常甲状腺细胞系Nthy-ori 3-1,甲状腺乳头状癌细胞系TPC-1中p62蛋白表达明显升高。3.通过CCK-8法和平板集落形成实验检测细胞生长情况,可见p62敲低后,集落形成的能力减弱,细胞生长速度明显变缓(P>0.05)。4.流式细胞术分析显示,抑制TPC-1细胞中p62的表达可使G1期细胞比例降低,S期细胞比例升高(P>0.05),结合CCK-8和平板集落形成的实验结果,表明敲除p62后TPC-1细胞周期被阻滞在了S期;敲除p62后细胞凋亡率上升(P>0.05)。通过Western Blot检测TPC-1及p62-KO-TPC-1细胞中Bax和Bcl-2蛋白的表达,可见敲除p62后Bax的表达量明显增多,Bcl-2的表达明显减少。5.通过transwell侵袭迁移实验可见,敲除p62后,穿过transwell小室固定染色的细胞数明显减少,细胞侵袭和迁移能力明显降低。6.通过定期测瘤体体积绘制瘤体生长曲线可见,接种p62-KO-TPC-1细胞的瘤体增长更平缓,曲线下移,生长能力明显减弱,对照组TPC-1接种后瘤体生长曲线更陡峭,生长能力明显快,差异具有统计学意义(P﹤0.05);剥离瘤体后测瘤重,可以见到接种TPC-1细胞的瘤体较大,有统计学差异(P﹤0.05)。7.瘤体免疫组化染色可见,实验组p62-KO-TPC-1瘤体组织p62蛋白低表达,且增殖相关蛋白P53、PTEN、PCNA染色较深,表达水平明显高于对照组TPC-1,差异具有统计学意义(P﹤0.05)。8.Western Blot实验结果表明,敲除p62后ERK,AKT,CDK1蛋白的表达显著降低。同时,p62-KO-TPC-细胞中p-AKT表达增加,说明p62缺乏可以促进AKT磷酸化,激活蛋白激酶的功能。在TPC和p62-KO-TPC-1细胞中,m TOR的表达未见明显变化,在m TOR抑制剂雷帕霉素处理后m TOR的表达均下降。检测TPC-1和p62-KO-TPC-1细胞中使用自噬抑制剂Bafilomycin A1前后自噬相关蛋白LC3的表达,结果显示p62敲除可诱导LC3-II的积累,表现为自噬激活。结果结论:1.在肿瘤组织中p62m RNA的表达异常增高,且其高表达与肿瘤大小存在相关,在细胞TPC-1中p62蛋白也表现出异常累积;2.在TPC-1细胞中,p62促进细胞增殖和侵袭迁移,抑制细胞凋亡,动物实验也表明p62有促进肿瘤生长的作用;3.p62可能通过ERK/AKT/AMPK通路调控肿瘤细胞的增殖作用;4.p62可能通过Bcl-2介导的线粒体通路抑制细胞凋亡。