肺动脉高压(pulmonary arterial hypertension,PAH)是严重危害人类健康易致死亡的心肺血管疾病,如果未及时诊断和积极治疗,患者早期中位生存期不超过3年。PAH主要特征为肺血管功能和结构发生进行性改变,可导致右心衰竭而死亡。低氧是诱发和加重PAH的常见致病因素之一,它能够导致肺血管内环境紊乱,发生严重的血管功能与结构的改变。在肺动脉血管重构过程中,PASMC(pulmonary artery smooth muscle cell,PASMC)的表型转换、增殖、迁移和凋亡失衡是PAH发生发展的重要环节。作为典型的PAH保护性信号通路,BMP-Smadl/5-PPARγ的激活可以对抗PAH致病信号通路TGF-β-Smad3,发挥重要的血管保护作用。同时越来越多的研究证明血管保护因子的泛素化和去泛素化调控在PAH中也发挥着重要的作用。我们近来研究,腺苷酸激活蛋白激酶(AMP-activated protein kinase,AMPK)磷酸化血管紧张素转化酶2(Angiotensin-converting enzyme 2,ACE2)能够有效地抑制其泛素化降解而发挥PAH保护作用,但是其泛素化调控机制尚未明确。而我们同时证实了激活ANP-cGMP-PKG通路可有效抑制缺氧诱导的PAH形成,同时观察到给予cGMP处理可直接上调PASMC内去泛素化酶BRCC36表达,但上调的BRCC36是否参与调控低氧诱导的PAH及肺血管重构形成,目前国内外也尚未见有相关报道。因此,深入阐明肺血管重构中关键信号分子的泛素化修饰调控机制对深入了解PAH发生机制以及开发新的作用药物靶点具有十分重要的意义。BRCC36参与多种细胞生物学过程,在细胞信号传导、DNA损伤修复过程中均发挥重要作用,可特异性水解底物上赖氨酸残基63位点(K63)泛素链,从而降低底物的泛素化修饰水平。在对BRCC36基因整体功能研究中,Miskinyte等对三例家族性脑底异常血管网病(烟雾病)患者的基因分析证实,该疾病的发生与患者类淋巴母细胞系BRCC3基因的前3个外显子缺失突变而导致BRCC36表达缺失有关,同时这类患者还具有高血压,扩张型心肌病及早发冠心病等表现。而在斑马鱼的研究中观察到,敲除BRCC3基因可导致血管生成缺陷。这些研究提示BRCC36在调节血管结构及功能中可能具有重要作用。作为一种特异性去泛素化酶,BRCC36是否会影响上述经典的BMP/TGF-β-PPARγ通路,从而通过调控PASMC的生物学特性来参与慢性缺氧诱导的肺血管重构及PAH形成,有待进一步的实验研究。同时寻找有效的药物治疗PAH也是需要迫切解决的问题。丹皮酚(Paeonol,PAE)是从中草药毛茛科植物牡丹(Paeonia suffruticosa Andr.)的干燥根皮中通过化学萃取的一种2’-羟基-4’-甲氧基苯乙酮。PAE具有镇痛解热、降压抗凝、抗炎抗氧化和抑制变态反应的作用,被临床广泛用于治疗心肌缺血、动脉粥样硬化、减少缺血再灌注损伤的脑梗死等心脑血管疾病。基于其抗炎抗增殖的特性及降血压作用,我们通过本项实验研究从多角度初步探讨PAE对慢性缺氧诱导的PAH和肺血管重构的疗效及潜在的机制。为此,我们通过信息学预测、大数据分析及收集临床患者标本研究ACE2的E3泛素连接酶MDM2在PAH中的表达情况及MDM2对ACE2的泛素化调控机制。用C57BL/6小鼠经过慢性缺氧(Chronic hypoxia)干预构建的慢性PAH模型,检测肺血管中去泛素化酶BRCC36、BMP信号通路因子,转化生长因子TGF-β1及下游细胞因子的表达变化;而后构建平滑肌特异性过表达BRCC36的转基因小鼠,探讨调节血管内BRCC36对慢性缺氧诱导的PAH及肺血管重构的影响及可能机制;其次通过原代培养大鼠的PASMC和调节细胞内BRCC36表达的重组腺病毒,在细胞水平直接探讨BRCC36与BMP/TGF-β-PPARγ信号通路的相互作用及可能环节从而揭示BRCC36在调节PASMC增殖、迁移、凋亡和细胞外基质表达的作用及机制;最后,在整体动物水平,初步探讨PAE对慢性缺氧诱导的肺血管重构及肺高血压形成的作用及对BRCC36表达的影响。研究内容分为三章:第一章MDM2调控ACE2泛素化参与PAH及血管重构的病理过程目的:明确E3泛素连接酶MDM2调控ACE2在慢性缺氧诱导的PAH及肺血管重构中的具体作用。方法:通过生物信息学预测和大数据分析E3泛素连接酶MDM2在PAH中的表达情况和对血管舒张因子ACE2的调控作用。我们收集临床上特发性PAH患者的肺组织通过免疫印记的方法观察PAH患者肺组织的MDM2和ACE2的表达水平。同时检测MDM2和ACE2在实验性小鼠PAH发生过程中表达变化,并检测MDM2敲除或过表达对ACE2稳定性及泛素化的影响。最后通过慢性缺氧+Su5416构建野生雄性小鼠的慢性低氧PAH模型,进行右心室测压和相对右心室重量(Fulton Index)指标评估右心室功能和结构的改变。通过H&E染色和Angiogram血管造影评价MDM2抑制剂JNJ-165对慢性缺氧诱导的PAH及肺血管重构的保护作用。结果:生物信息学预测MDM2作为ACE2的泛素化E3连接酶得分最高,大数据显示MDM2在家族性PAH中高表达。同时在人肺组织临床标本和动物实验中,MDM2在PAH患者肺组织和实验性小鼠肺组织中表达明显上调。通过蛋白印迹分析MDM2可以调控血管舒张因子ACE2的稳定性及泛素化降解。对比各组小鼠的右心室收缩压及相对右心室重量结果,慢性缺氧后右心室压力增加及Fulton Index增加,组织染色显示肺血管重构,肺小血管闭塞减少肺血流灌注,而给予作为MDM2泛素化抑制剂JNJ-165可以明显减少右心收缩压、右心室肥厚及血管重构等病理改变。结论:在慢性缺氧诱导的PAH及肺血管重构过程中,E3泛素连接酶MDM2的过度活化和对ACE2泛素化降解调控使其失去PAH保护性作用是介导PAH发生过程的一个重要因素,提示泛素化调控参与了慢性缺氧诱导的PAH及肺血管重构。运用MDM2泛素化抑制剂JNJ-165可以有效地抑制PAH和肺血管重构,提示JNJ-165可以被进一步研究作为PAH的临床治疗药物而拓宽低氧性PAH的临床药品的应用。第二章BRCC36对慢性缺氧诱导的PAH及肺血管重构的作用及机制目的:1)观察实验动物低氧性PAH和临床患者肺组织标本中BRCC36蛋白表达的动态变化;2)明确平滑肌细胞特异性过表达BRCC36小鼠在慢性缺氧诱导的PAH及肺血管重构中的具体作用;3)探讨BRCC36对BMP/TGF-β-PPARγ及下游信号通路调控的分子机制。方法:利用慢性缺氧构建PAH模型,血流动力学和免疫染色实验来评估造模情况;免疫印迹用于检测实验小鼠肺组织中BRCC36、BMPRⅡ、TGF-β1、PPARγ及id1蛋白表达情况;通过收集临床上特发性PAH患者的肺组织及离体培养PASMC,检测BRCC36蛋白在患者体内的表达水平。构建平滑肌细胞特异性过表达BRCC36转基因小鼠并进行低氧性PAH造模,通过血流动力学及免疫染色来评价BRCC36对慢性缺氧诱导的PAH及肺血管重构的保护作用,通过免疫印迹来检测过表达BRCC36对肺组织内BMP/TGF-β-PPARγ信号通路的影响,并检测相关凋亡蛋白的表达变化。细胞水平上,构建消减/过表达BRCC36的重组腺病毒体外感染原代培养的PASMC,采用qPCR、免疫印迹、免疫荧光染色、细胞增殖凋亡实验等,观察BRCC36对BMP2诱导的Smad1/5磷酸化及BMP通路的激活的影响,观察BRCC36对TGF-β1诱导的Smad3磷酸化、靶基因转录调控及对PASMC增殖、凋亡及迁移的影响,进一步探讨BRCC36对BMP/TGF-β-PPARγ及下游信号通路的具体调节机制。结果:对比低氧处理小鼠的血流动力学及血管染色情况,显示其右心室肥厚,肺小血管肌化,血管中膜增厚,肺动脉周围弹力纤维增加,凋亡减少,这些提示慢性缺氧诱导的PAH模型建立成功。蛋白印迹结果显示慢性缺氧后肺组织中BRCC36表达水平下降,同时观察到转化生长因子TGF-β1表达上调,PAH保护信号因子BMPRII,PPARγ及id1水平明显下调,并随缺氧持续时间的延长而更加明显,提示慢性缺氧可诱导TGF-β1信号通路过度激活及BMP信号通路的抑制,在这个过程BRCC36蛋白表达明显降低。同时发现BRCC36在特发性PAH患者肺组织和离体培养的PASMC中表达也明显降低。在平滑肌细胞特异性过表达BRCC36小鼠上,我们通过右心室收缩压的结果观察到,过表达BRCC36能够缓解慢性缺氧诱导的右心室压力增加。Fulton Index提示右心室肥厚得到有效抑制。H&E染色及弹力纤维染色显示肺动脉重构缓解,能够有效减少肺血管肌化因子α-SMA和I型胶原减少为主。免疫印迹结果显示上调肺组织内BRCC36的表达能够有效的降低慢性缺氧诱导的肺内TGF-β1的表达增加,增强BMP-PPARγ-id1通路的活化。此外,肺组织内过表达BRCC36可缓解慢性缺氧诱导的肺细胞凋亡抑制,抑制肺组织促增殖蛋白Bcl-XL的表达,增强促凋亡蛋白Bax、Bid和活化的Casβase3表达。在细胞分子水平上,我们证实,在低氧抑制BMP信号的同时也抑制了 BRCC36的表达,而给予BMP信号通路激活配体BMP2激活Smad1/5-PPARγ信号通路的同时,可诱导BRCC36表达升高,提示BRCC36可能是BMP-PPARγ信号通路的一种内源性正向调控因子。对比转染空载腺病毒的PASMC,细胞内过表达BRCC36能够增强BMP2诱导的Smad1/5磷酸化,激活下游信号因子PPARy,aβoE和id1的表达。有趣的是,BRCC36并不是直接通过增加BMPRII而是通过ALK2来调控BMP信号通路。同时BRCC36能够缓解低氧诱导的BMP信号通路抑制,抑制低氧诱导的凋亡因子Bax、Bid、Casβase3表达的下降。此外,TGF-β1诱导的PASMC增殖、迁移及细胞外基质的分泌也受到抑制。结论:在慢性缺氧诱导的PAH及肺血管重构过程中,TGF-β1的过度活化和BMP信号通路保护性作用的丢失是介导这一过程的重要因素,同时证实去泛素化酶BRCC36的表达发生了显著的动态变化,提示BRCC36可能参与了慢性缺氧诱导的PAH及肺血管重构,与BMP/TGF-β1-PPARγ信号通路关系密切。在IPAH患者的肺组织中BRCC36的表达明显下调,这为PAH的诊断和治疗提供新的参考方向。平滑肌特异性过表达BRCC36对慢性缺氧诱导的PAH及肺血管重构具有保护作用,这一作用可能与激活BMP-PPARy通路以及抑制TGF-β-Smad3通路,促进细胞凋亡和减少细胞增殖有关。细胞实验表明了 BRCC36对BMP/TGF-β-PPARγ通路的具有重要的调控作用。去泛素化酶BRCC36增强BMP2诱导的Smad1/5磷酸化及降低TGF-β1诱导的Smad3的磷酸化,从而正向调控BMP/PPARγ信号通路的激活和负性调控TGF-β1/Smad3信号通路,可抑制TGF-β1诱导的PASMC的增殖、迁移及细胞外基质基因的表达。而BRCC36能够被BMP2诱导性表达升高,从而实现对BMP/TGF-β-PPARγ信号通路的调节。第三章丹皮酚对PAH及肺血管重构的疗效及对BRCC36表达水平的影响目的:观察丹皮酚对慢性缺氧诱导的PAH及肺血管重构的疗效以及是否与调节BRCC36表达有关。方法:将C57BL/6小鼠随机分为常氧对照组、低氧对照组、低氧低剂量PAE干预组(100ug/kg/day)和低氧高剂量PAE干预组(200ug/kg/day)。通过右心室测压称重、H&E染色、弹力纤维染色、免疫组织化学染色、免疫印迹等方法评价PAE对慢性缺氧诱导的PAH及肺血管重构的疗效,初步探讨PAE的疗效是否与调节BRCC36表达有关。结果:与低氧PAH组相比,PAE可改善慢性缺氧诱导的右心室压力、右心室结构及功能变化;促进BMP信号通路的激活,抑制低氧诱导的PAH及肺血管重构,抑制增殖蛋白的表达及增加凋亡蛋白的表达;降低促纤维化因子TGF-β1及下游Smad3磷酸化水平的表达;同时检测到BRCC36表达水平的提高。结论:PAE可改善慢性缺氧诱导的PAH及肺血管重构,其机制可能与激活BMP-Smad1/5-PPARγ信号通路,抑制TGF-β1-Smad3 的表达有关。PAE对BMP/TGF-β-PPARγ信号通路的调节作用与上调BRCC36的表达,增强BRCC36对BMP/TGF-β-PPARγ信号通路的调控关系密切。