研究目的: 1.了解敌匹硫磷、残杀威和双酚A单独暴露及联合暴露对小鼠巨噬细胞和脾淋巴细胞毒件。 2.探讨敌匹硫磷、残杀威和双酚A单独暴露及联合暴露对小鼠巨噬细胞吞噬功能的影响。 3.了解敌匹硫磷、残杀威和双酚A单独暴露及联合暴露对NK细胞免疫功能的影响。 材料与方法: 1敌匹硫磷、残杀威与双酚A对小鼠巨噬细胞RAW264.7细胞和小鼠脾淋巴细胞毒作用1.1受试物和细胞的选择开展敌匹硫磷、残杀威和双酚A进行体外非特异性免疫细胞毒性研究。采用小鼠巨噬细胞株RAW364.7细胞和小鼠脾淋巴细胞作为受试细胞。 1.2敌匹硫磷、残杀威和双酚A单独及联合暴露对RAW264.7细胞和脾淋巴细胞毒作用采用1h、4h、12h、24h、48h、72h作为受试物单独暴露对RAW264.7细胞的染毒时间，而选用1h、2h、4h、8h、16h、24h作为受试物单独暴露对脾淋巴细胞的染毒时间，每时间点均设计同一剂量系列。通过MTT法检测细胞毒性。观察敌匹硫磷、残杀威和双酚A单独暴露对RAW264.7细胞和脾淋巴细胞活性的时间效应关系，确定适宜的染毒时间。观察既定染毒时间内受试物单独暴露的剂量效应关系，用概率单位法计算受试物的半数抑制浓度(IC50)及其95％置信区间(CI)。依据单独暴露的IC50，将敌匹硫磷与双酚A、残杀威与双酚A按等毒性比混合，了解联合暴露对RAW264.7细胞和脾淋巴细胞活性的剂量效应关系，求得联合暴露的IC50。 1.3敌匹硫磷、残杀威和双酚A对RAW264.7细胞和脾淋巴细胞毒性联合作用评价根据敌匹硫磷、残杀威和双酚A单独暴露及联合暴露IC50，采用相加系数法，评价敌匹硫磷与双酚A、残杀威与双酚A对RAW264.7细胞和脾淋巴细胞毒性的联合作用方式。 2敌匹硫磷、残杀威与双酚A对小鼠巨噬细胞RAW264.7细胞和小鼠脾NK细胞功能的影响受试物和细胞的选择同第1章。 2.1敌匹硫磷、残杀威与双酚A单独暴露和联合暴露对RAW264.7细胞吞噬功能影响的剂量效应关系采用巨噬细胞吞噬荧光微球流式细胞术，确定敌匹硫磷、残杀威和双酚A单独暴露对RAW264.7细胞吞噬功能影响的剂量效应关系。根据单独暴露IC50，将敌匹硫磷与双酚A、残杀威与双酚A按等毒性比混合，确定混合物的剂量效应关系。根据单独暴露与联合暴露的剂量效应关系，选择适宜剂量进行2×2析因分析实验，确定敌匹硫磷与双酚A、残杀威与双酚A的联合作用方式。 2.2敌匹硫磷、残杀威与双酚A单独暴露和联合暴露对脾NK细胞免疫功能影响的剂量效应关系采用乳酸脱氢酶(LDH)释放法，研究敌匹硫磷、残杀威和双酚A单独暴露对小鼠NK细胞杀伤活性的剂量效应关系。根据单独暴露IC50，将敌匹硫磷与双酚A、残杀威与双酚A按等毒性比混合，确定受试物联合暴露的剂量效应关系。与此同时，对雌雄小鼠来源的脾NK细胞杀伤活性进行比较，以观察受试物在体外条件下对NK细胞杀伤活性是否存在性别差异。 根据单独暴露与联合暴露的剂量效应关系，选择适宜剂量进行2×2析因分析实验，以特异性杀伤活性和反映脾活化NK细胞比例的表面抗原CD69+/NKG2D+表达水平作为检测终点，综合判定敌匹硫磷与双酚A、残杀威与双酚A的联合作用方式。 结果: 1敌匹硫磷、残杀威与双酚A单独暴露和联合暴露对小鼠巨噬细胞RAW264.7细胞和小鼠脾淋巴细胞的细胞毒作用1.1敌匹硫磷、残杀威与双酚A单独及联合暴露对RAW264.7细胞毒作用1.1.1时间效应关系敌匹硫磷、残杀威和双酚A对RAW264.7细胞存活率的影响表现为随着染毒剂量的增加以及染毒时间的延长而改变，且染毒剂量与染毒时间之间存在明显的交互作用。根据时间效应关系研究结果，确定染毒时间为24h。 1.1.2剂量效应关系1.1.2.1敌匹硫磷、残杀威与双酚A单独暴露对RAW264.7细胞毒作用的剂量效应关系染毒24h，敌匹硫磷、残杀威与双酚A对RAW264.7细胞的IC50(95％CI)分别为：敌匹硫磷163.9mg/L(125.6mg/L～302.9mg/L)，残杀威425.2mg/L(329.9mg/L～606.4mg/L)，双酚A34.3mg/L(30.8mg/L～38.8mg/L)。 1.1.2.2敌匹硫磷、残杀威与双酚A联合暴露对RAW264.7细胞毒作用的剂量效应关系根据单独暴露的IC50，将敌匹硫磷和双酚A、残杀威和双酚A按等毒性比混合，敌匹硫磷与双酚A混合物、残杀威与双酚A混合物对RAW264.7细胞的IC50(95％CI)分别为：敌匹硫磷与双酚A混合物157.3mg/L(143.7mg/L～175.8mg/L)，残杀威与双酚A混合物258.4mg/L(238.5mg/L～281.2mg/L)。 1.1.3敌匹硫磷、残杀威和双酚A对RAW264.7细胞毒作用的联合作用评价根据相加系数法的计算公式及判定标准，敌匹硫磷与双酚A联合暴露对RAW264.7细胞毒性主要表现为拮抗作用，残杀威与双酚A联合暴露对RAW264.7细胞联合毒性主要表现为相加作用。 1.2敌匹硫磷、残杀威与双酚A单独及联合暴露对小鼠脾淋巴细胞毒作用1.2.1时间效应关系受试物对小鼠脾淋巴细胞存活率的影响表现为随着染毒剂量的增加以及染毒时间的延长而改变，且染毒剂量与染毒时间之间存在明显的交互作用。根据时间效应关系研究结果，确定1h为染毒时间。 1.2.2剂量效应关系1.2.2.1敌匹硫磷、残杀威与双酚A单独暴露对脾淋巴细胞毒作用的剂量效应关系染毒1h，敌匹硫磷、残杀威与双酚A受试物单独暴露对小鼠脾淋巴细胞的IC50(95％CI)分别为：敌匹硫磷81.9mg/L(63.4mg/L～113.8mg/L)，残杀威2727.8mg/L(2512.7mg/L～2978.9mg/L)，双酚A147.4mg/L(104.4mg/L～226.0mg/L)。 1.2.2.2敌匹硫磷、残杀威与双酚A联合暴露对脾淋巴细胞毒作用的剂量效应关系根据单独暴露的IC50，将敌匹硫磷和双酚A、残杀威和双酚A按等毒性比进行混合，敌匹硫磷与双酚A混合物、残杀威与双酚A混合物对RAW264.7细胞的IC50(95％CI)分别为：敌匹硫磷与双酚A混合物109.6mg/L(85.4mg/L～141.6mg/L)，残杀威与双酚A混合物1070.1mg/L(929.1mg/L～1244.2mg/L)。 1.23敌匹硫磷、残杀威和双酚A对脾淋巴细胞毒作用的联合作用评价根据相加系数法的计算公式及判定标准，敌匹硫磷与双酚A联合暴露对小鼠脾淋巴细胞毒性表现为相加作用，残杀威与双酚A联合暴露对小鼠脾淋巴细胞联合毒性主要表现为相加作用。 2敌匹硫磷、残杀威与双酚A单独暴露和联合暴露对RAW264.7细胞和小鼠脾NK细胞免疫功能的影响2.1敌匹硫磷、残杀威与双酚A单独及联合暴露对RAW264.7细胞吞噬功能的影响2.1.1敌匹硫磷、残杀威与双酚A单独及联合暴露对RAW264.7细胞功能影响的剂量效应关系双酚A(1.1×10-4mg/L～18mg/L)能增强RAW264.7吞噬荧光微球的能力，而敌匹硫磷(38.6mg/L～80.0mg/L)与残杀威(35.6mg/L～120.0mg/L)则抑制RAW264.7的吞噬功能。 根据单独暴露的IC50，将敌匹硫磷和双酚A、残杀威和双酚A按等毒性比进行混合。敌匹硫磷和双酚A混合物(62.5mg/L～90.0mg/L)、残杀威和双酚A混合物(25.7mg/L和130.0mg/L)对RAW264.7细胞吞噬能力均主要表现为抑制作用。 2.1.2敌匹硫磷、残杀威和双酚A对RAW264.7细胞吞噬功能影响的联合作用评价60.0mg/L敌匹硫磷和12.0mg/L双酚A、48.0mg/L残杀威和4.0mg/L双酚A对PP和PI的影响均存在交互作用，且均为拮抗作用。 2.2敌匹硫磷、残杀威与双酚A单独及联合暴露对脾NK细胞免疫功能的影响2.2.1适宜效应细胞靶细胞比例(简称效靶比，E/T)的确定固定靶细胞(YAC-1细胞)的密度为1×105个/ml，依次改变小鼠脾淋巴细胞密度，获得不同E/T值。同时接种相应不同密度的脾淋巴细胞，除了不加入YAC-1细胞外，其余同前。结果表明，100是最适宜本研究的E/T值。不同性别来源的NK细胞特异性杀伤活性差异无显著性(P<0.05)。 结论: 1.敌匹硫磷、残杀威与双酚A单独与联合暴露对巨噬细胞的毒作用大小顺序为：双酚A>敌匹硫磷>残杀威，敌匹硫磷与双酚A混合物>残杀威与双酚A混合物；敌匹硫磷、残杀威与双酚A单独与联合暴露对脾淋巴细胞的毒性大小顺序为：敌匹硫磷>双酚A>残杀威，敌匹硫磷与双酚A混合物>残杀威与双酚A混合。 2.在单独暴露条件下，敌匹硫磷和残杀威能抑制巨噬细胞的吞噬功能和NK细胞的杀伤活性；双酚A则针对不同的免疫细胞产生不同的毒作用，表现为促进巨噬细胞吞噬能力和抑制NK细胞的杀伤活性。 3.在联合暴露条件下，敌匹硫磷与双酚A对巨噬细胞活性和吞噬功能的影响均呈拮抗作用，而对脾淋巴细胞活性和NK细胞功能的影响则呈现相加作用；残杀威与双酚A对巨噬细胞活性的影响表现为相加作用，对其吞噬功能的影响则表现为拮抗作用，残杀威与双酚A联合暴露对脾淋巴细胞活性和NK细胞功能的影响均表现为相加作用。