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番茄斑萎病毒属（Tospovirus）是布尼亚病毒科（Bunyaviridae）中侵染植物的一个病毒属,病毒基因组为三分体负义单链RNA。该属病毒目前包括20多种病毒,根据地理分布的不同,该属病毒可进一步分为欧亚型番茄斑萎病毒属病毒和美洲型番茄斑萎病毒属病毒。番茄斑萎病毒（Tomato spotted wilt virus,TSWV）是番茄斑萎病毒属的典型种,该病毒被列为十大最具科学重要性和农业重要性的植物病毒中的第二位,病毒寄主范围广泛,能侵染82科1000多种植物,由蓟马持久性循回增殖传播,每年在全世界范围内造成农业、园艺和观赏性植物上极为严重的经济损失。拟南芥具有基因组信息全面、遗传体系完善和突变体库完整等优点,使拟南芥成为研究植物与病原微生物互作的最重要的模型植物之一。本研究致力于云南和海南的番茄斑萎病毒属病毒种类鉴定,并在此基础上,在拟南芥中建立番茄斑萎病毒属病毒的侵染体系,为病毒与寄主互作研究提供良好的遗传学研究体系。本研究在云南和海南分离了 5种番茄斑萎病毒属病毒,并建立了该属病毒侵染拟南芥的体系,发现拟南芥的不同发育龄期对番茄斑萎病毒属病毒的侵染具有重要的影响,并对其初步机制进行了探析。主要研究内容包括以下三方面:1.云南番茄斑萎病毒属病毒种类鉴定与拟南芥侵染体系的建立本研究对云南地区进行了番茄斑萎病毒属病毒的田间调查与鉴定。该属病毒的为害主要集中在番茄、辣椒、烟草和蜘蛛兰等经济作物或观赏性植物上,局部田块发病率高达90%以上。通过ELISA和RT-PCR手段鉴定到番茄斑萎病毒（Tomato spotted wilt virus,TSWV）、番茄环纹斑点病毒（Tomato zonate spot virus,TZSV）、凤仙花坏死斑病毒（Impaliens necrotic spot virus,INSV）和朱顶红褪绿环斑病毒（Hippeastrum chlorosis ringspot virus,HCRV）。TSWV莴苣株系的寄主测试表明该株系能够成功侵染本氏烟（Nicotiana benthamiana）、普通烟草（Nicotiana tabacum）cv.K326、黄烟（Nicotiana rustica）、辣椒（Capsicum annuum）、曼陀罗（Datura stramonium）、莴苣（Lactucasativa）、一点红（Emilia sonchifolia）、菎黎（Chenopodium quinoa）、矮牵牛（Petunia hybrida）、番茄（Solanum lycopersicum）等植物。通过拟南芥上的浓度测试、症状发展观察和回接本氏烟并用RT-PCR检测,成功建立TSWV、TZSV和INSV摩擦接种侵染拟南芥的体系。2.海南番茄斑萎病毒属辣椒褪绿病毒的鉴定、全基因组序列测定和特有的S基因间隔区起源及拟南芥侵染体系的建立本研究对海南也进行了番茄斑萎病毒属病毒的鉴定,通过该属病毒的通用引物在蜘蛛兰上分离鉴定了辣椒褪绿病毒（Capsicum chlorosis virus,CaCV）,并将其命名为CaCV-Hainan。在此基础上,进一步测定了 CaCV-Hainan的全长基因组序列,全长基因组RNAS、M和L分别包含3629、4859和8912个核苷酸（nt）。进一步序列分析发现,非常特别的是,CaCV-Hainan的S基因组RNA的基因间隔区特别长,含有1348 nt,而M基因组RNA的基因间区域大小则只有462 nt。进一步对来自全世界不同的CaCV分离物之间的序列比较显示,CaCV-Hainan的S链RNA基因间隔区起源自另一个基因间隔区特别长的澳大利亚分离物CaCV-Q1d-3432,但比CaCV-Qld-3432的S链IGR缺失了 25 nt和325 nt长的两个区段。此外,CaCV-Hainan的S链RNA IGR有两段未知来源的10nt和20nt长度的插入序列。另外,本研究还发现,来自台湾的CaCV-Ph分离物和来自泰国的CaCV-NRA分离物的S基因组RNA的基因间隔区也源自于CaCV-Qld-3432,与CaCV-Qld-3432相比较,其中有一段218nt长度的序列发生了缺失。通常情况下在番茄斑萎病毒属病毒的种间才会有非常显著的基因间隔区的变异,本研究发现CaCV种内的S基因组基因间隔区变化很大该研究结果为CaCV IGR的结构变异和进化起源提供了有价值的新见解。另外,用摩擦接种方法,成功建立了CaCV侵染拟南芥Col-0的侵染体系。3.不同发育阶段决定番茄斑萎病毒属病毒在拟南芥上的侵染率及初步机制探析植物对病原微生物的老熟抗性是非常常见的一种现象,当植物处于幼龄期时,容易被病原菌感染,而当植物生长到成熟期时,则不容易被病原菌感染。然而,本论文在番茄斑萎病毒侵染拟南芥的研究过程中,却发现了相反的情况。我们的研究发现,拟南芥龄期越小越不容易被番茄斑萎病毒属病毒感染,随着拟南芥发育龄期的增加,番茄斑萎病毒属病毒对拟南芥的感染率也随之增加。当用TSWV-LE分离株接种3周龄拟南芥时,发现接种的拟南芥植物通常不发病,在4、5和6周龄拟南芥中,TSWV-LE分离株的感染率分别为9%、21%和25%,但接种拟南芥7-8周龄时,全部接种植物都被感染且在30天后感病死亡。不同的番茄斑萎病毒分离株TSWV-YN对幼龄拟南芥的侵染也表现出较低的感染率,随着发育龄期的增加,则对拟南芥的感染率升高,表明不同的TSWV分离株侵染拟南芥时侵染率均受发育龄期影响的特性。本研究进一步对Tospovirus属内另外两种病毒进行了拟南芥不同龄期的侵染测试,一种为来自欧亚型番茄斑萎病毒属的番茄环纹斑点病毒（Tomato zonate spot virus,TZSV）,另一种为来自美洲型番茄斑萎病毒属的凤仙花坏死斑病毒（Impatiens necrotic spot virus,INSV）,研究结果表明这两种分别来自亚洲和美洲的番茄斑萎病毒属病毒在拟南芥上的侵染率依然表现出随着发育龄期的增加而增加的特性,因此,不同类型的番茄斑萎病毒属病毒在拟南芥上的侵染也均受到不同发育阶段的调控。另外本研究还对植物正义链RNA病毒黄瓜花叶病毒（Cucumber mosaic virus,CMV）侵染不同龄期的拟南芥进行了侵染测定,发现CMV在拟南芥上的侵染也在一定程度上受发育阶段的影响。在以上研究结果的基础上,本研究进一步对番茄斑萎病毒属病毒侵染拟南芥受发育调控的特性进行了机制的初步探索。幼龄期拟南芥不能被番茄斑萎病毒属病毒感染的一种可能机制是拟南芥存在对该类病毒的幼龄期抗性。本研究测试了 RNA沉默的抗病毒途径是否参与了该过程,当用番茄斑萎病毒TSWV-LE分离株感染不同龄期的拟南芥突变体dcl 2/3/4或rd 1/2/6时,发现在不同发育阶段,TSWV-LE在这些RNA沉默拟南芥突变的感染率与野生型拟南芥没有任何差异,表明即使拟南芥存在幼龄期抗性,那么RNA沉默的抗病毒途径也与幼龄期拟南芥不容易被TSWV感染的现象无关。番茄斑萎病毒属病毒侵染拟南芥随着龄期增加侵染率增加的另一种可能机制是病毒侵染所必需的感病寄主因子的表达受到不同发育阶段的调控,在低龄期感病寄主因子表达少,病毒难侵染,随着龄期的增加,感病寄主因子随之增加,从而病毒侵染率增加。通过基因轰击试验表明,TSWV的移动蛋白在8周龄的拟南芥叶片中发生细胞间运动的效率显著高于4周龄拟南芥叶片,表明TSWV的胞间移动确实受到植物不同发育阶段的调控。果胶甲酯酶和β-1,3-葡聚糖酶是已知参与胞间连丝通透性的重要蛋白酶并已被证明在多种植物病毒的胞间移动中发挥重要作用,本研究对4周龄和8周龄拟南芥中的果胶甲酯酶和β-1,3-葡聚糖酶表达水平测定表明,这两个基因在8周龄拟南芥叶片中的表达显著高于4周龄拟南芥叶片,并且当TSWV感染拟南芥时,参与胼胝质降解的β-1,3-葡聚糖酶在8周龄拟南芥中大量上调,而该基因在4周龄拟南芥叶片中虽然也发生上调,但是感染病毒后的上调倍数依然显著低于8周龄未感染TSWV拟南芥中的水平。以上这些研究结果表明,番茄斑萎病毒属病毒侵染拟南芥受到不同发育阶段的调控,因此在拟南芥中可能存在受发育调节的感病寄主因子,这些感病寄主因子与病毒互作决定了番茄斑萎病毒属病毒在拟南芥上的感染效率。