非酒精性脂肪肝病（Non-alcoholic fatty liver disease,NAFLD）已成为世界上最普遍的一种肝脏疾病,是动物和人类健康的隐形杀手。目前认为,脂肪肝发生是因为食物中饱和脂肪酸含量过高、肥胖和胰岛素抵抗等造成肝细胞中脂质异位沉积所引起。另外,炎症反应及氧化应激在脂肪肝从简单的肝脏脂肪变性发展成脂肪性肝炎（non-alcoholic steatohepatitis,NASH）、肝纤维化至肝癌这一复杂过程中起到不可忽视的作用。丁酸是研究最为广泛的短链脂肪酸之一,它是由4个C原子组成的一元羧酸,是肠道微生物群以膳食纤维为底物发酵而来。肠道内形成的丁酸通过肝门静脉进入血液到达各组织器官发挥多种生物学效应。丁酸不仅是肠上皮细胞能量的主要来源,还可以作为信号分子结合G蛋白偶联受体（G protein-coupled receptor,GPR）激活下游通路或通过抑制组蛋白去乙酰化酶（Histone deacetylase,HDAC）调控基因表达,从而发挥其生物学效应。丁酸具有抑制炎症、抵抗氧化应激、抗肿瘤和提高胰岛素敏感性等生理功能。目前研究表明,丁酸钠对NAFLD具有缓解作用,但丁酸钠作用的靶向分子及其作用机制尚不明确,并且以往研究主要关注丁酸钠对NAFLD的预防作用,其治疗功效报道较少。因此,我们采用高脂日粮饲喂SD大鼠诱导肥胖和NAFLD模型,后灌服丁酸钠研究其对肥胖及NAFLD的治疗作用,并采用油酸诱导AML12小鼠肝实质细胞构建体外高脂模型,通过对关键基因进行功能缺失进一步明确丁酸钠缓解高脂引起的NAFLD的作用机制。1灌服丁酸钠缓解肥胖及胰岛素抵抗24只6周龄SPF级SD雄性大鼠,饲养适应一周后,随机分为两组;高脂组大鼠（HF）饲喂脂肪供能45%的高脂日粮诱,对照组（CON）大鼠饲喂脂肪供能10%的正常日粮,光照12 h和黑暗12 h,22±2℃,50%-60%湿度环境饲养,自由采食饮水并记录每周体重增长情况。9周后,HF组大鼠体重高于正常组约20%,确认大鼠模型建立成功。通过葡萄糖耐受实验（Glucose tolerance test,GTT）检测大鼠对胰岛素的敏感性,结果显示,HF组GTT线下面积显著高于CON组（P<0.05）,提示,HF组大鼠发生了胰岛素抵抗或葡萄糖不耐受。随后将HF组大鼠平均分为2组:丁酸钠处理组（HFB）按300 mg/kg剂量灌服丁酸钠;空白对照组（CON）和高脂对照组同时灌服等体积的生理盐水,隔天灌胃,总共灌胃7周。试验结果显示,与HF组相比,HFB组大鼠体重在第12～16周显著下降（P<0.05）;肝脏重、附睾脂肪重和肝重/体重都明显降低。在腹腔注射葡萄糖30 min-120min时血糖均显著降低（P<0.05）,并且丁酸钠增加了胰岛素信号通路相关分子胰岛素受体底物-1（Insulin receptor substrate-1,IRS-1）、磷脂酰肌醇 3（Phosphatidylinositol 3 kinase,PI3K）、磷酸化蛋白激酶 B（Phosphorylated protein kinase B,p-AKT）的蛋白表达,说明灌服丁酸钠激活肝脏胰岛素信号通路缓解高脂日粮引起的葡萄糖不耐受。另外,高脂饮食显著提升了谷草转氨酶（Aspartate aminotransferase,AST）和谷丙转氨酶（Alanine aminotransferase,ALT）的水平,灌服丁酸钠后二者显著降低（P<0.05）。以上结果表明,灌服丁酸钠能够有效缓解高脂日粮诱导的肥胖、葡萄糖不耐受及肝损伤。2 丁酸钠通过调节肝脏脂代谢缓解高脂诱导的NAFLD采用HE和油红染色的方法对肝脏组织形态学进行检测。结果显示:丁酸钠灌服处理后,肝脏内的脂质蓄积显著下降;与HF组相比,HFB组肝脏组织中总胆固醇（Total cholesterol,Tch）含量没有发生改变,但甘油三酯（Triglyceride,TG）含量显著降低（P<0.05）。我们对肝脏脂质代谢相关指标进行检测,结果显示,脂解相关的激素敏感酯酶（Hormone sensitive lipase,HSL）和甘油三酯水解酶（Adipose triglyceride lipase,ATGL）mRNA的表达水平及蛋白水平在HF组和HFB组中均没有发生明显改变,p-HSL蛋白表达含量也未发生改变,而脂合成关键酶乙酰辅酶羧化酶（Acetyl CoA carboxylase,ACC）、脂肪酸合成酶（Fatty acid synthase,FAS）蛋白表达水平显著降低（P<0.05）。此外,β氧化的关键分子过氧化物酶体增殖剂激活受体（Peroxisome proliferators-activated receptors alpha,PPARα）及肉碱棕榈酰基转移酶（Carnitine palmityl transferase 1,CPT1）的mRNA和蛋白表达水平都显著升高（P<0.05）。另外,检测了大鼠肝脏组织中线粒体自身编码的基因表达,除个别基因外大部分无显著变化。但是,线粒体复合物酶Ⅲ和线粒体复合物酶V酶活性显著升高（P<0.05）。与之一致,线粒体功能蛋白细胞色素c氧化酶亚基1（Cytochrome c oxidase subunit 1,COX1）和细胞色素c氧化酶亚基4（Cytochrome c oxidase subunit,COX4）蛋白水平显著升高（P<0.05）。以上结果表明,灌服丁酸钠能够通过降低脂合成并促进线粒体功能增加β氧化,缓解高脂饮食诱导的NAFLD。3 丁酸钠抑制炎症缓解高脂诱导的NAFLD采用荧光定量PCR的方法对肝脏组织中炎症相关分子进行检测。结果表明:与HF组相比,HFB组肝脏组织中炎症标志物白介素1 β（Interleukin-1 β,IL-1 β）、白介素 6（Interleukin-6,IL-6）、肿瘤坏死因子 α（Tumornecrosis factor α,TNFα）、单核细胞趋化蛋白-1（Monocyte chemotactic protein-1,MCP1）和白介素 18（Interleukin-18,IL-18）的mRNA表达水平显著降低（P<0.05）,且IL-1β、IL-6、TNFα蛋白表达量也显著下降（P<0.05）。进一步利用免疫荧光染色方法检测发现,与HF组相比,肝脏组织中促炎的M1样巨噬细胞减少且抑炎的M2型巨噬细胞增加。与其一致,M1样巨噬细胞标志物F4/80蛋白表达显著降低（P<0.05）,M2型巨噬细胞标志物CD206蛋白表达显著增加（P<0.05）。我们对炎症通路NF-κB和NLRP3的相关分子表达进行检测,结果显示:与HF组相比,HFB组Toll样受体4（Toll-likereceptor4,TLR4）、Toll 样受体 2（Toll-like receptor 2,TLR2）和 p65 mRNA 表达水平显著降低（P<0.05）,p-IKKα/β、p-p65蛋白表达显著下降（P<0.05）,表明NF-κB信号通路被明显抑制;NLRP3 和凋亡相关斑点样蛋白（Apoptosis-associated speck-like protein containing CARD,ASC）mRNA表达水平以及NLRP3和Cleaved Caspase-1蛋白水平显著下降（P<0.05）,说明NLRP3信号通路亦同样受到了抑制。HFB组短链脂肪酸受体GPR41和GPR43的蛋白表达没有发生明显改变。但组蛋白去乙酰化酶1（Histone deacetylase,HDAC1）蛋白表达水平显著降低（P<0.05）。进一步采用染色质免疫共沉淀（Chromatin Immunoprecipitation,ChIP）检测发现,丁酸钠没有影响 TLR4、p65、IL-1β、NLRP3、ASC和CPT1启动子区H3K9Ac的含量,但PPARα基因启动子上H3K9Ac的富集程度显著提高（P<0.05）。通过免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation,Co-IP）检测发现,HF组与CON比较,PPARα与p-p65蛋白质之间的相互作用显著降低（P<0.05）,口服丁酸钠显著增加两者之间的互作（P<0.05）。以上结果表明,在肝脏组织中丁酸钠能够作为去乙酰化酶抑制剂增加PPARα启动子乙酰化程度,提高PPARα的表达,增加PPARα与p-p65相互作用,抑制NF-κB和NLRP3炎症相关通路的激活,从而缓解NAFLD。4 丁酸钠抑制氧化应激缓解高脂诱导的NAFLD高脂日粮可引起肝脏中抗氧化应激标志物谷胱甘肽还原酶（Glutathione reductase,GSH）和超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase,SOD）活性显著降低（P<0.05）,脂质氧化终产物丙二醛（Malondialdehyde,MDA）含量显著增加（P<0.05）,口服丁酸钠可使GSH、SOD和MDA恢复到正常水平,说明丁酸钠缓解了高脂饮食造成的机体氧化应激。进一步通过荧光定量PCR及Western blot的方法检测核因子-E2相关因子2（nuclear factor E2-related factor 2,Nrf2）转录及蛋白水平,发现与 HF 组相比,HFB组Nrf2的mRNA转录及蛋白表达水平均显著升高（P<0.05）,并且受Nrf2调控的下游抗氧化应激酶谷氨酸半胱氨酸合成酶（Glutamate-cysteine ligase,GCL）亚单位GCLC、GCLM 和 NADPH 醌氧化还原酶 1（NADPH-quinone oxidoreductasel,NQO1）和血红素氧合酶1（hemeoxygenase-1,HO-1）的mRNA表达水平显著升高（P<0.05）。为了探究丁酸钠调控Nrf2表达机制,进一步通过ChIP试验检测发现,与HF组相比,HFB组中Nrf2基因启动子上H3K9Ac的富集程度显著升高（P<0.05）。以上结果表明,丁酸钠能够增加Nrf2基因启动子乙酰化程度,促进Nrf2的表达,从而增加了其下游抗氧化酶的转录提高了机体的抗氧化应激能力。为了进一步明确Nrf2在丁酸钠缓解NAFLD中的重要作用,我们使用siRNA处理AML12小鼠肝实质细胞干扰Nrf2的表达。结果显示,丁酸钠能够缓解油酸引起的ROS增加,显著提高GSH、SOD的酶活（P<0.05）,增加Nrf2及其下游抗氧化酶GCLC、NQO-1和HO-1的水平（P<0.05）。siRNA敲低Nrf2逆转了丁酸钠对高脂造成氧化应激的缓解作用,并且发现,PPARα蛋白表达在敲低Nrf2后有降低趋势。综上所述,丁酸钠能作为去乙酰化酶抑制剂,增加PPARα和Nrf2启动子乙酰化程度激活PPARα和Nrf2,从而从脂质代谢,抑制炎症、抵抗氧化应激等多方面缓解高脂诱导的NAFLD。