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目的肺癌已成为全世界范围内发病人数最多且死亡率很高的癌症种类。小细胞肺癌（SCLC）和非小细胞肺癌（NSCLC）是肺癌的两种主要的病理分型,其中NSCLC占肺癌总数的大多数。目前有确切证据表明,大多数肿瘤患者死于肿瘤的转移和复发,侵袭性生长和转移潜能是肿瘤高死亡率的根本原因,因此阐明NSCLC的关键侵袭转移机制,有针对性的研究NSCLC的早期诊断标志物和治疗靶标、明确其调控机制,具有重要的意义。长链非编码RNAs（lnc RNAs）的长度大于200个核苷酸,在功能上不具有编码蛋白质的能力。许多研究表明lnc RNAs参与了包括NSCLC在内的多种肿瘤的侵袭转移过程。本研究旨在明确lnc RNA染色体相关RNA 10（chromosome associated RNA 10,CAR10）通过调控GJB2来促进非小细胞肺癌的侵袭转移作用及其具体作用机制。方法1.长链非编码RNA CAR10在非小细胞肺癌中的表达及其临床意义（1）采用生物信息学分析CAR10在Gene Expression Omnibus（GEO）数据库中非小细胞肺癌相关数据集GSE19188、GSE30219和GSE118370中的表达。（2）收集50例非小细胞肺癌患者的癌及癌旁组织标本,采用皮尔森卡方检验（Pearson Chi-Square test）及Fisher精确检验分析不同CAR10表达水平与NSCLC临床特征的相关性。（3）应用RT-qPCR的方法检测CAR10在人支气管上皮细胞16HBE及NSCLC细胞系A549、H1299和H1975中的表达。2.长链非编码RNA CAR10调控GJB2促进非小细胞肺癌A549和H1299迁移及侵袭能力的实验研究（1）设计并构建特异性CAR10小干扰RNA（small interfering RNA,siRNA）,采用细胞转染的方式构建不同CAR10表达水平的非小细胞肺癌细胞系,并用RTq PCR的方法进行验证;采用Transwell实验检测不同CAR10表达水平细胞的迁移及侵袭能力的影响。（2）分析GEO数据库中的非小细胞肺癌相关数据集GSE19188、GSE30219和GSE118370差异表达的基因;通过Kaplan-Meier分析筛选差异表达的基因与NSCLC患者预后的相关性;免疫组织化学法检测不同分级非小细胞肺癌组织中GJB2的表达水平;应用RT-qPCR的方法检测GJB2在人支气管上皮细胞16HBE及非小细胞肺癌细胞系A549、H1299、SPCA1和H1975中的差异表达。（3）根据GSE19188、GSE30219和GSE118370数据集中CAR10和GJB2表达的read值,Spearman相关分析CAR10和GJB2表达的相关性;采用Westernblot法检测不同CAR10表达水平对非小细胞肺癌细胞系A549和H1299细胞中GJB2蛋白的表达水平的影响;用Transwell实验检测不同CAR10水平对非小细胞肺癌细胞系A549和H1299细胞的迁移及侵袭能力的影响。（4）在A549和H1299细胞中共转染CAR10过表达质粒（oeCAR10）及特异性GJB2小干扰RNA（siGJB2）,同步转染空白对照（oeCTR及siSCR）,采用Transwell实验检测改变GJB2表达水平对CAR10介导的非小细胞肺癌细胞系A549和H1299细胞的迁移及侵袭能力的影响。3.长链非编码RNA CAR10作为ceRNA调控GJB2促进A549和H1299迁移及侵袭的机制研究（1）通过在线预测网站（RegRNA 2.0,miRWalk,miRDB和Targetscan）预测可以和GJB2或者CAR10相互作用的miRNAs,选取这4个数据库中miRNAs的交集,共筛选出5种可能和CAR10及GJB2相互作用的miRNAs;分析非小细胞肺癌相关数据集GSE19945中miR-892a的表达情况;采用RT-qPCR的方法检测50例非小细胞肺癌患者的癌和癌旁组织中miR-892a的表达水平;Spearman相关分析miR-892a和GJB2表达的相关性。（2）在A549和H1299细胞中转染miR-892a的模拟物和抑制物,用RT-qPCR的方法检测构建的细胞模型中miR-892a的表达水平;采用Western-blot的方法,检测不同miR-892a表达水平的非小细胞肺癌细胞A549及H1299中GJB2蛋白的表达水平。（3）在A549细胞中共转染miR-892a的模拟物（miR-892a mimic）及GJB2过表达质粒（oe GJB2）,同步转染空白对照（NC mimic及oeCTR）,用Transwell实验检测改变GJB2表达水平对miR-892a介导的非小细胞肺癌细胞系A549细胞的迁移及侵袭能力的影响;相反地,在H1299细胞中共转染miR-892a的抑制物（miR-892a inhibitor）及特异性GJB2小干扰RNA（siGJB2）同步转染空白对照（NC inhibitor及siSCR）,用Transwell实验检测改变GJB2表达水平对miR-892a介导的非小细胞肺癌细胞系H1299细胞的迁移及侵袭能力的影响;采用Tagertscan软件在线预测miR-892a和GJB2的结合靶点,构建含有miR-892a结合位点的野生型报告质粒（GJB2-luc-WT）和含有miR-892a突变结合位点的突变型报告质粒（GJB2-luc-MUT）,将GJB2-luc-WT与miR-892a mimic及GJB2-luc-MUT与miR-892a mimic分别共转染至非小细胞肺癌细胞A549及H1299中,检测荧光素酶的活性。（4）在A549和H1299细胞中共转染CAR10过表达质粒（oeCAR10）及miR-892a模拟物（miR-892a mimics）,同步转染空白对照（oeCTR及NC mimic）,采用Western-blot的方法,检测改变miR-892a和CAR10表达水平对非小细胞肺癌细胞A549及H1299中GJB2蛋白的表达水平的影响;采用在线分析软件预测CAR10与miR-892a的结合靶点,构建含有miR-892a结合位点的野生型报告质粒（CAR10-luc-WT）和含有miR-892a突变结合位点的突变型报告质粒（CAR10-lucMUT）,将CAR10-luc-WT与miR-892a mimic及CAR10-luc-MUT与miR-892a mimic分别共转染至非小细胞肺癌细胞A549及H1299中,检测荧光素酶的活性。（5）在A549及H1299细胞中分别或共转染CAR10过表达质粒（oeCAR10）、GJB2小干扰RNA（siGJB2）、miR-892a抑制物（miR-892a inhibitor）和含有miR-892a突变位点的CAR10过表达质粒（oeCAR10-MUT）,同步转染空白对照（oeCTR）,将细胞分为oeCTR组、oeCAR10组、oeCAR10-MUT组、oeCAR10+siGJB2组及oeCAR10+siGJB2+miR-892a inhibitor组,采用Western-blot的方法,检测改变miR-892a、CAR10和GJB2表达水平对非小细胞肺癌细胞A549及H1299中GJB2蛋白的表达水平的影响;在相同分组的情况下,用Transwell实验检测改变miR-892a、CAR10和GJB2表达水平对非小细胞肺癌细胞A549及H1299细胞的迁移及侵袭能力的影响。结果1.长链非编码RNA CAR10在非小细胞肺癌中的表达及其临床意义（1）生物信息学分析显示:CAR10在Gene Expression Omnibus（GEO）数据库中非小细胞肺癌相关数据集GSE19188、GSE30219和GSE118370中癌组织的表达高于其在癌旁或正常肺组织的表达。（2）皮尔森卡方检验（Pearson Chi-Square test）及Fisher精确检验分析50例非小细胞肺癌患者的癌及癌旁组织标本显示:更高表达的CAR10与更高的病理分级（P=0.000）与更频繁的淋巴结转移（P=0.018）有关;单因素方差分析（One-way ANOVA）不同淋巴结分期患者的CAR10的表达量表明:非小细胞肺癌患者的淋巴结分期越高,患者CAR10的表达量越高;Kaplan-Meier分析发现:CAR10的高表达与患者更短的生存时间有关（P=0.014）。（3）RT-qPCR检测发现:CAR10在非小细胞肺癌细胞系（A549、H1299和H1975）中的表达明显高于其在人支气管上皮细胞16HBE的表达（P<0.001）。2.长链非编码RNA CAR10调控GJB2促进非小细胞肺癌A549和H1299迁移及侵袭能力的实验研究（1）RT-qPCR检测三种CAR10小干扰RNA（small interfering RNA,siRNA）在非小细胞肺癌细胞系A549、H1299中的转染效率显示:转染si CAR10-2的细胞中CAR10的表达量最低（P<0.01）;RT-qPCR检测转染si CAR10-2和CAR10过表达的质粒（oeCAR10）的非小细胞肺癌细胞系A549、H1299中CAR10的表达水平显示:细胞中CAR10的表达水平分别降低和增高（P<0.01;P<0.0001）;Transwell实验显示:下调CAR10的表达削弱了非小细胞肺癌细胞系A549、H1299细胞的迁移及侵袭能力,增加CAR10的表达促进了非小细胞肺癌细胞系A549、H1299细胞的迁移及侵袭能力（P<0.01）。（2）筛选了8个在三个数据集中都存在的差异表达的基因,分别是:COL11AL、MMP12、SPP1、KRT6A、MMP1、GJB2、SCG5和HS6ST2;明确这8个基因在GSE19188、GSE30219和GSE118370中的差异表达的倍数及Kaplan-Meier生存分析筛选差异表达的基因与NSCLC患者预后的相关性后,筛选出GJB2;免疫组织化学的方法明确了随着非小细胞肺癌患者临床分级的增加,GJB2的表达量增多（p<0.0001）;RT-qPCR的方法明确GJB2在非小细胞肺癌细胞系A549、H1299、SPCA1和H1975中的表达明显高于其在人支气管上皮细胞16HBE的表达（p<0.001）。（3）皮尔森相关分析明确了在非小细胞肺癌相关数据集GSE19188、GSE30219和GSE118370中CAR10与GJB2的表达呈正相关;Western-blot结果显示:在非小细胞肺癌细胞系A549、H1299中下调或者上调CAR10的表达可以降低或增加GJB2蛋白的表达（P<0.01）;Transwell实验表明:在非小细胞肺癌细胞系A549、H1299中,过表达CAR10后,细胞的迁移及侵袭能力增强,在过表达CAR10的同时沉默GJB2的表达,可降低过表达CAR10对细胞迁移及侵袭能力的促进作用（P<0.001）。（4）在A549和H1299细胞中共转染CAR10过表达质粒（oeCAR10）及特异性GJB2小干扰RNA（siGJB2）,同步转染空白对照（oeCTR及siSCR）,采用Transwell实验检测改变GJB2表达水平对CAR10介导的非小细胞肺癌细胞系A549和H1299细胞的迁移及侵袭能力的影响。3.长链非编码RNA CAR10作为ceRNA调控GJB2促进A549和H1299迁移及侵袭的机制研究（1）在线预测网站预测了5种可以和GJB2或者CAR10相互作用的miRNAs;分析非小细胞肺癌相关数据集GSE19945表明:miR-892a在癌组织中的表达明显低于其在正常肺组织中的表达;RT-qPCR的方法明确:miR-892a在50例非小细胞肺癌患者的癌组织中的表达明显低于其在癌旁组织中的表达;Spearman相关分析明确miR-892a和GJB2的表达呈负相关。（2）RT-qPCR明确:在非小细胞肺癌细胞系A549和H1299中转染miR-892a的模拟物（miR-892a mimics）和抑制物（miR-892a inhibitor）,细胞中的miR-892a的表达水平增高和降低（P<0.01;P<0.0001）;Western-blot的方法检测:在非小细胞肺癌细胞系A549和H1299中,上调或者下调miR-892a的表达可以降低或增加GJB2蛋白的表达（P<0.01）。（3）Transwell实验结果显示:在非小细胞肺癌细胞系A549中转染miR-892a模拟物后,细胞的迁移及侵袭能力减低,而转染miR-892a模拟物同时转染GJB2过表达质粒,过表达GJB2可以逆转过表达miR-892a对A549细胞迁移及侵袭能力的抑制作用（P<0.001）;在H1299细胞中转染miR-892a抑制物后,细胞的迁移及侵袭能力增强,而转染miR-892a抑制物同时转染GJB2小干扰RNA,下调GJB2可以逆转沉默miR-892a对A549细胞迁移及侵袭能力的促进作用（P<0.001）;双荧光素酶实验表明:在非小细胞肺癌细胞系A549、H1299中,过表达的miR-892a能够显著降低GJB2野生型质粒连接的荧光素酶的活性,而对GJB2突变型质粒连接的荧光素酶的活性却无显著影响（P<0.01）。（4）Western-blot结果显示:在非小细胞肺癌细胞系A549、H1299中转染CAR10过表达质粒后,细胞中GJB2蛋白的表达水平增高,转染CAR10过表达质粒同时转染miR-892a模拟物后,GJB2的表达比oeCAR10组的表达降低（P<0.01）;双荧光素酶实验表明:在非小细胞肺癌细胞系A549、H1299中,过表达的miR-892a能够显著降低CAR10野生型质粒连接的荧光素酶的活性,而对CAR10突变型质粒连接的荧光素酶的活性却无显著影响（P<0.01）。（5）Western-blot结果显示:在非小细胞肺癌细胞系A549、H1299中转染CAR10过表达质粒后,细胞中GJB2蛋白的表达水平增高,在转染含有miR-892a突变位点的CAR10过表达质粒（oeCAR10-MUT）后GJB2蛋白的表达水平降低;在转染siGJB2后,GJB2蛋白的表达水平降低较转染oeCAR10组的降低;在同步转染siGJB2和miR-892a抑制物后,细胞的GJB2蛋白的表达水平升高（P<0.01）;Transwell实验验证:在非小细胞肺癌A549、H1299中转染CAR10过表达质粒后,细胞的迁移侵袭能力增强;在转染含有miR-892a突变位点的CAR10过表达质粒（oeCAR10-MUT）后细胞的迁移侵袭能力减弱;在转染siGJB2后,细胞的迁移侵袭能力较转染oeCAR10组的减弱;在同步转染siGJB2和miR-892a抑制物后,细胞的迁移及侵袭能力增强（P<0.01）。结论1.CAR10在非小细胞肺癌的组织及细胞中均高表达且与患者的临床特点有关。2.高表达CAR10的非小细胞肺癌细胞系A549、H1299的迁移及侵袭能力增强;GJB2在非小细胞肺癌组织及细胞系中的表达均增高且与患者的不良预后有关;GJB2参与CAR10介导的非小细胞肺癌的迁移及侵袭作用。3.MiR-892a在非小细胞肺癌组织中低表达且与GJB2的表达呈负相关;CAR10促进GJB2诱导的侵袭转移是通过粘附miR-892a实现的。