目的:本研究通过观察中药潞党参对小鼠皮肤组织IL-6、TNF-α、IL-15及其受体、MAPK/ERK1/2信号通路、PI3K/Akt信号通路的影响。探讨潞党参调控小鼠皮肤光老化过程中的作用机制,为医美领域研发新的中药抗衰老产品提供新的实验依据。材料与方法:将90只SPF级昆明小鼠随机分为空白对照组、模型对照组、潞党参高剂量组、潞党参中剂量组、潞党参低剂量组、VE对照组、Anti-IL-15组、MAPK抑制剂组、PI3K抑制剂组。除了空白对照组之外,其余8组均需进行光老化造模。造模采用UVA+UVB光源,即40w UVA灯管2根,40w UVB灯管2根,将4根灯管并列穿插安装到自制模拟日光箱中,照射小鼠背部皮肤制备光老化模型。用剃毛器将小鼠背部约为1.5×1.5cm~2的长毛及绒毛剔除,每隔两至三日剃毛一次,将剃毛后的小鼠放入笼中,同时照射UVA、UVB。每周照射3次,共计14周。造模成功后,采用灌胃给药途径,连续给药4周,每日一次。空白对照组和模型对照组均灌注生理盐水,潞党参的各个组中(包括高剂量组、中剂量组和低剂量组)灌服不同浓度的潞党参,VE组灌服维生素E作为阳性对照物,Anti-IL-15组、MAPK抑制剂组、PI3K抑制剂组三组灌服相应的制剂。于第19周断颈处死全部小鼠,取下小鼠背部正中全层皮肤,置于冰箱内冷冻(-70℃)保存待测。酶联免疫吸附法(ELISA)检测小鼠皮肤组织中IL-6、TNF-α、IL-15水平;免疫荧光法(IF)检测小鼠皮肤组织中IL-15、IL-15R水平以及IL-15与IL-15R共表达的情况;Western-blot法和免疫组化法(IHC)检测小鼠皮肤组织中IL-15、IL-15R、MAPK、P-MAPK、PI3K、P-PI3K、ERK1/2、P-ERK1/2、Akt、P-Akt的蛋白表达水平。结果:1光老化模型制备UVA辐照强度累计为261.79J/cm~2,UVB辐照强度累计为6.54J/cm~2,照射强度值均符合皮肤光老化动物实验的紫外线照射强度要求。照射14周后小鼠出现身体疲乏倦怠、经常收缩一团、运动量降低、皮肤干枯、表皮粗糙、纹理加粗加深、皮肤颜色出现暗红,偶有瘀斑等现象,比照光老化模型标准已经完全符合,造模成功。2 ELISA法检测结果:空白对照组中IL-6、TNF-α、IL-15呈现低水平表达。(1)IL-6水平:与空白对照组比较,模型对照组的小鼠皮肤组织中IL-6的表达显著升高(P<0.01);与模型对照组比较,潞党参的各个组中(包括高剂量组、中剂量组和低剂量组)小鼠皮肤组织中IL-6的表达显著降低(P<0.01)。与VE组比较,潞党参低剂量组IL-6的表达显著升高(P<0.01);潞党参中剂量组IL-6的表达变大(P<0.05);而潞党参高剂量组与其差异不具有统计学意义。(2)TNF-α水平:与空白对照组比较,模型对照组的小鼠皮肤组织中TNF-α的表达显著升高(P<0.01);与模型对照组比较,潞党参的各个组中(包括高剂量组、中剂量组和低剂量组)小鼠皮肤组织中TNF-α的表达显著降低(P<0.01)。与VE组比较,潞党参低剂量组TNF-α的表达显著升高(P<0.01);潞党参中剂量组TNF-α的表达升高(P<0.05);而潞党参高剂量组与其差异不具有统计学意义。(3)IL-15水平:与空白对照组比较,模型对照组的小鼠皮肤组织中IL-15的表达显著升高(P<0.01);与模型对照组比较,潞党参的各个组中(包括高剂量组、中剂量组和低剂量组)小鼠皮肤组织中IL-15的表达显著降低(P<0.01)。与VE组比较,潞党参低剂量组IL-15的表达显著升高(P<0.01);潞党参中剂量组IL-15的表达升高(P<0.05);而潞党参高剂量组与其差异不具有统计学意义。3 IF法检测结果(1)IL-15、IL-15R、IL-15与IL-15R共表达在各组内均有阳性表达。(2)IL-15水平:小鼠皮肤组织中IL-15在空白对照组的表达水平较低;与空白对照组比较,模型对照组的小鼠皮肤组织中IL-15表达显著升高(P<0.01);与模型对照组比较,潞党参的各个组中(包括高剂量组、中剂量组和低剂量组)小鼠皮肤组织中IL-15的表达显著降低(P<0.01)。与VE组比较,潞党参低剂量组、潞党参中剂量组IL-15的表达显著升高(P<0.01);而潞党参高剂量组与其差异不具有统计学意义。(3)IL-15R水平:小鼠皮肤组织中IL-15R在空白对照组的表达水平较低;与空白对照组比较,模型对照组的小鼠皮肤组织中IL-15R表达显著升高(P<0.01);与模型对照组比较,潞党参的各个组中(包括高剂量组、中剂量组和低剂量组)小鼠皮肤组织中IL-15R的表达显著降低(P<0.01)。与VE组比较,潞党参低剂量组、潞党参中剂量组IL-15R的表达显著升高(P<0.01);而潞党参高剂量组与其差异不具有统计学意义。(4)IL-15与IL-15R共表达水平:小鼠皮肤组织中IL-15与IL-15R共表达在空白对照组的表达水平较低;与空白对照组比较,模型对照组的小鼠皮肤组织中IL-15与IL-15R共表达水平显著升高(P<0.01);与模型对照组比较,潞党参的各个组中(包括高剂量组、中剂量组和低剂量组)小鼠皮肤组织中IL-15与IL-15R共表达的水平显著降低(P<0.01)。与VE组比较,潞党参低剂量组、潞党参中剂量组IL-15与IL-15R共表达的水平显著升高(P<0.01);而潞党参高剂量组与其差异不具有统计学意义。4 Western-blot法检测结果(1)IL-15、IL-15R蛋白表达(1)IL-15蛋白表达:与空白对照组比较,模型对照组IL-15的蛋白表达显著升高(P<0.01);而与模型对照组比较,中药剂量组IL-15的蛋白表达显著降低(P<0.01);与抗IL-15抗体对照组比较,中药剂量组IL-15的蛋白表达升高(P<0.05)。(2)IL-15R蛋白表达:与空白对照组比较,模型对照组IL-15R的蛋白表达显著升高(P<0.01);而与模型对照组比较,中药剂量组IL-15R的蛋白表达显著降低(P<0.01);与抗IL-15抗体对照组比较,中药剂量组IL-15R的蛋白表达升高(P<0.05)。(2)MAPK、P-MAPK蛋白表达(1)MAPK蛋白表达:与空白对照组比较,模型对照组MAPK的蛋白表达显著升高(P<0.01);而与模型对照组比较,中药剂量组MAPK的蛋白表达显著下降(P<0.01);与抗IL-15抗体对照组比较,中药剂量组MAPK的蛋白表达显著升高(P<0.01)。(2)P-MAPK蛋白表达:与空白对照组比较,模型对照组P-MAPK的蛋白表达显著升高(P<0.01);而与模型对照组比较,中药剂量组P-MAPK的蛋白表达显著下降(P<0.01);与抗IL-15抗体对照组比较,中药剂量组P-MAPK的蛋白表达显著升高(P<0.01)。(3)PI3K、P-PI3K蛋白表达(1)PI3K蛋白表达:与空白对照组比较,模型对照组PI3K的蛋白表达显著升高(P<0.01);而与模型对照组比较,中药剂量组PI3K蛋白表达显著下降(P<0.01);与抗IL-15抗体对照组比较,中药剂量组PI3K的蛋白表达显著升高(P<0.01)。(2)P-PI3K蛋白表达:与空白对照组比较,模型对照组P-PI3K的蛋白表达显著升高(P<0.01);而与模型对照组比较,中药剂量组P-PI3K蛋白表达显著下降(P<0.01);与抗IL-15抗体对照组比较,中药剂量组P-PI3K的蛋白表达显著升高(P<0.01)。(4)ERK1/2、P-ERK1/2蛋白表达(1)ERK1/2蛋白表达:与空白对照组比较,模型对照组中ERK1/2的蛋白表达水平显著升高(P<0.01);与模型对照组比较,中药剂量组小鼠皮肤组织中ERK1/2蛋白表达水平显著降低(P<0.01);与MAPK抑制剂组比较,中药剂量组小鼠皮肤组织中ERK1/2的蛋白含量的表达水平显著升高(P<0.01)。(2)P-ERK1/2蛋白表达:与空白对照组比较,模型对照组中P-ERK1/2的蛋白表达水平显著升高(P<0.01);与模型对照组比较,中药剂量组小鼠皮肤组织中P-ERK1/2蛋白表达水平显著降低(P<0.01);与MAPK抑制剂组比较,中药剂量组小鼠皮肤组织中P-ERK1/2的蛋白含量的表达水平显著升高(P<0.01)。(5)Akt、P-Akt蛋白表达(1)Akt蛋白表达:与空白对照组比较,模型对照组中Akt的蛋白表达水平显著升高(P<0.01);与模型对照组比较,中药剂量组小鼠皮肤组织中Akt蛋白表达水平显著降低(P<0.01);与MAPK抑制剂组比较,中药剂量组小鼠皮肤组织中Akt的蛋白含量的表达水平显著升高(P<0.01)。(2)P-Akt蛋白表达:与空白对照组比较,模型对照组中P-Akt的蛋白表达水平显著升高(P<0.01);与模型对照组比较,中药剂量组小鼠皮肤组织中P-Akt蛋白表达水平显著降低(P<0.01);与MAPK抑制剂组比较,中药剂量组小鼠皮肤组织中P-Akt的蛋白含量的表达水平显著升高(P<0.01)。5 IHC法检测结果(1)IL-15、IL-15R蛋白表达(1)IL-15蛋白表达:与空白对照组比较,模型对照组IL-15的平均光密度值显著升高(P<0.01);与模型对照组比较,中药剂量组IL-15的平均光密度值显著降低(P<0.01);与抗IL-15抗体对照组比较,中药剂量组IL-15的平均光密度值升高(P<0.05)。(2)IL-15R蛋白表达:与空白对照组比较,模型对照组IL-15R的平均光密度值显著升高(P<0.01);与模型对照组比较,中药剂量组IL-15R的平均光密度值显著降低(P<0.01);与抗IL-15抗体对照组比较,中药剂量组IL-15R的平均光密度值升高(P<0.05)。(2)MAPK、P-MAPK蛋白表达(1)MAPK蛋白表达:与空白对照组比较,模型对照组MAPK的平均光密度值显著升高(P<0.01);与模型对照组比较,中药剂量组MAPK的平均光密度值显著降低(P<0.01);与抗IL-15抗体对照组比较,中药剂量组MAPK的平均光密度值显著升高(P<0.01)。(2)P-MAPK蛋白表达:与空白对照组比较,模型对照组P-MAPK的平均光密度值显著升高(P<0.01);与模型对照组比较,中药剂量组P-MAPK的平均光密度值显著降低(P<0.01);与抗IL-15抗体对照组比较,中药剂量组P-MAPK的平均光密度值显著升高(P<0.01)。(3)PI3K、P-PI3K蛋白表达(1)PI3K蛋白表达:与空白对照组比较,模型对照组PI3K的平均光密度值显著升高(P<0.01);与模型对照组比较,中药剂量组PI3K的平均光密度值显著降低(P<0.01);与抗IL-15抗体对照组比较,中药剂量组PI3K的平均光密度值显著升高(P<0.01)。(2)P-PI3K蛋白表达:与空白对照组比较,模型对照组P-PI3K的平均光密度值显著升高(P<0.01);与模型对照组比较,中药剂量组P-PI3K的平均光密度值显著降低(P<0.01);与抗IL-15抗体对照组比较,中药剂量组P-PI3K的平均光密度值显著升高(P<0.01)。(4)ERK1/2、P-ERK1/2蛋白表达(1)ERK1/2蛋白表达:与空白对照组比较,模型对照组ERK1/2的平均光密度值显著升高(P<0.01);与模型对照组比较,中药剂量组ERK1/2、的平均光密度值显著降低(P<0.01);与MAPK抑制剂组比较,中药剂量组ERK1/2的平均光密度值显著升高(P<0.01)。(2)P-ERK1/2蛋白表达:与空白对照组比较,模型对照组P-ERK1/2的平均光密度值显著升高(P<0.01);与模型对照组比较,中药剂量组P-ERK1/2的平均光密度值显著降低(P<0.01);与MAPK抑制剂组比较,中药剂量组P-ERK1/2的平均光密度值显著升高(P<0.01)。(5)Akt、P-Akt蛋白表达(1)Akt蛋白表达:与空白对照组比较,模型对照组Akt的平均光密度值显著升高(P<0.01);与模型对照组比较,中药剂量组Akt的平均光密度值显著降低(P<0.01);与PI3K抑制剂组比较,中药剂量组Akt的平均光密度值显著升高(P<0.01)。(2)P-Akt蛋白表达:与空白对照组比较,模型对照组P-Akt的平均光密度值显著升高(P<0.01);与模型对照组比较,中药剂量组P-Akt的平均光密度值显著降低(P<0.01);与PI3K抑制剂组比较,中药剂量组P-Akt的平均光密度值显著升高(P<0.01)。结论:1皮肤光老化过程中有较多炎症因子产生,其中IL-15及其受体通过MAPK和PI3K信号转导通路分别激活蛋白激酶ERK1/2、Akt,导致MMPs表达增加,同时下调转化生长因子β/smad传导通路,可能是导致皮肤发生光老化的主要机制。2中药潞党参具有抗皮肤光老化的作用,其可能的作用机制之一是潞党参可以降低光老化小鼠皮肤组织中相关炎症因子的表达,直接或间接降低炎症因子及其受体对MAPK和PI3K信号转导通路相关基因和蛋白的影响。