人脐带血间充质干细胞外泌体改善烧伤大鼠急性肺损伤的作用机制研究

来源 :安徽医科大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:xiaojinzhu123
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背景与目的烧伤是指由热力、电能、化学物质、放射线等引起的组织伤害,主要是皮肤和粘膜的伤害。烧伤常常引起机体严重的炎症反应和器官损害。烧伤患者最常见的器官损伤并发症为肺部感染,严重烧伤后,机体的免疫功能下降,导致肺部感染加重,死亡率升高。急性肺损伤(Acute lung ingury,ALI)是大面积深度烧伤患者最常见的并发症之一,可引起机体缺氧,且患者极易发生急性呼吸窘迫综合征(Acute respiratory distress syndrome,ARDS),这也是造成烧伤患者高死亡率的原因之一。既往的研究发现,严重烧伤后肺组织损伤并发症发生发展的重要病理机制主要是炎症反应、氧化应激和肺组织细胞凋亡。间充质干细胞(Mesenchymal stem cells,MSCs)通过分化、自我更新和免疫调节能力,作为一种很有潜力治疗人类疾病的细胞,受到了广泛关注,在开发各种疾病治疗的新方法方面也具有巨大的潜力。MSCs可以从骨髓、脂肪组织、脐带和血液中等分离出来。然而,由于这些细胞的致瘤作用,其临床应用受到限制。研究显示,骨髓间充质干细胞的治疗效果在很大程度上取决于旁分泌因子,外泌体(exosome)。exosome是一种含有脂类、小分子RNA和蛋白质的纳米双层膜结构,在细胞间通讯中起着重要作用。由于其具有较低的免疫原性、致瘤性和易于管理等优点,exosome已成为一种新的有希望替代全细胞治疗的方法。此外,有研究显示,exosome可通过抗氧化、抗炎及抑制细胞凋亡发挥治疗人类疾病的作用。因此,本研究旨在探讨人脐带间充质干细胞(human unbilical cord mesenchymal stem cells,hUCMSCs)衍生的外泌体改善烧伤所致ALI的作用及其分子机制。方法在本研究中,购买的hUCMSCs培养3-5代后收集培养液上清,通过超速离心法分离出hUCMSCs-Exo。获得的hUCMSCs-Exo通过透射电镜、纳米粒子跟踪分析进行形态和大小分析,蛋白免疫印迹对exosome的特异性标志物CD63和CD9进行检测。采用qRT-PCR检测hUCMSCs和hUCMSCs-Exo中miR-451的表达。hUCMSCs中采用脂质体转染试剂分别转染miR-451 inhibitor及其对照序列(inhibitor NC),收集两组细胞的外泌体,即NCI-Exo和miR-451I-Exo。体内实验在大鼠中进行,大鼠分6组:sham,burn,burn+PBS,burn+Exo,burn+NCI-Exo,burn+miR-451I-Exo,burn通过热水烫伤法制备出总体面积30%III度烫伤模型,Exo注射组采用尾静脉注射hUCMSCs-Exo。在治疗后6h,检测各组大鼠肺功能指数差异;在治疗后6h,12h,24h和48h,分别收集各组大鼠外周血,ELISA检测血清中炎症因子IL-6,IL-1β和TNF-α的水平。在治疗后的24h和48h,分别处死大鼠,收集肺组织,ELISA检测肺组织匀浆中炎症因子IL-6,IL-1β和TNF-α的水平,氧化应激相关因子丙二醛(Malonaldehyde,MDA)的表达,髓过氧化物酶(Myeloperoxidase,MPO)和超氧化物歧化酶(Superoxide diamutase,SOD)的活性。通过HE染色观察肺组织的形态学变化。采用TUNEL法检测肺组织中细胞凋亡比例。采用蛋白免疫印迹检测TLR4/NF-κB信号通路的激活情况。结果1、从培养的hUCMSCs上清中成功分离出hUCMSCs-Exo,透射电镜显示其为球形囊泡,粒径分析其直径位于40-160nm,western blot结果显示其高表达exosome特异性标志物CD63和CD9。2、qRT-PCR证明hUCMSCs-Exo中miR-451富集表达,且抑制了miR-451后的hUCMSCs,其分泌的exosome中miR-451的表达也显著减少(p<0.05)。3、肺功能指数分析显示,与sham组相比,burn组大鼠最大吸气量减少,中心气道阻力增加,肺顺应性降低(p<0.05)。而Exo注射治疗后,可显著提高大鼠最大吸气量,降低中心气道阻力,且提高其肺顺应性(p<0.05)。此外,抑制了miR-451后的exosome注射对大鼠的肺功能改善明显减弱。4、血清中炎症因子表达检测显示,在不同的时间点,烫伤后的大鼠血清中IL-6,IL-1β和TNF-α的表达均显著增加(p<0.05),Exo注射后的大鼠,其炎症因子表达下降(p<0.05),抑制了miR-451后的exosome注射对血清中炎症因子的抑制作用减弱。此外,IL-6和IL-1β的水平在烫伤后6h达到最大值,随着时间延长,逐渐降低。与IL-6和IL-1β不同的是,TNF-α的水平在24h时达到最大值。5、肺组织中炎症因子的表达检测显示,与sham组相比,burn组大鼠肺组织匀浆中炎症因子表达水平显著增加(p<0.05),Exo注射的大鼠肺组织中炎症因子表达水平得到抑制(p<0.05),而抑制了miR-451后的exosome注射对炎症因子的抑制作用明显减弱。6、对TLR4/NF-κB信号通路的激活情况分析显示,burn组大鼠肺组织中TLR4/NF-κB信号通路呈激活状态,即TLR4和p-p65的表达显著上调(p<0.05)。Exo注射可显著抑制TLR4/NF-κB信号通路(p<0.05),而抑制了miR-451后的exosome注射对TLR4/NF-κB信号通路的抑制作用减弱。7、氧化应激相关分子表达/活性检测的结果显示,burn组大鼠肺组织中MDA水平和MPO活性均显著上调,SOD活性显著降低(p<0.05)。Exo注射后显著抑制了MDA水平和MPO活性,提高了SOD活性(p<0.05),而miR-451IExo的抗氧化作用显著减弱。8、HE染色观察肺组织病理损伤,sham组大鼠肺组织呈淡粉红色,肺组织结构清晰完成,肺泡壁薄无水肿,间质血管无扩张。Burn组可见肺泡结构明显紊乱且不完整,肺组织水肿,肺间质增厚。Exo注射组大鼠的肺组织及间质结构较完整,肺泡及肺间质的水肿有所减轻。对肺组织的损伤评分结果显示:burn组大鼠肺组织损伤显著大于sham组(p<0.05),Exo注射的大鼠肺组织损伤评分有显著减少(p<0.05),而抑制了miR-451后的exosome,其注射后的大鼠肺组织损伤评分显著增加(p<0.05)。9、肺组织凋亡细胞比例:TUNEL检测结果显示,burn组大鼠肺组织中细胞凋亡比例明显高于sham组(p<0.05),Exo注射的大鼠肺组织中凋亡细胞的比例显著减少(p<0.05),而miR-451I-Exo的抗凋亡作用显著减弱。结论1、本文从hUCMSCs中分离的exosome,是直径在40-160nm大小的具有膜结构的微小囊泡,表达外泌体共有的特异性蛋白CD63和CD9。2、hUCMSCs通过外泌体传递miR-451抑制烫伤大鼠体内TLR4/NF-κB信号通路激活和炎症因子表达;3、hUCMSCs通过外泌体传递miR-451降低烫伤大鼠体内氧化应激水平;4、hUCMSCs通过外泌体传递miR-451减少烫伤大鼠肺组织细胞凋亡,有效改善烫伤大鼠肺功能和肺组织损伤;
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