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半乳凝素-1（Gal-1）,半乳凝素家族的碳水化合物结合蛋白的成员,在肿瘤发生的各种细胞过程中发挥关键作用。Gal-1对多药耐药（MDR）乳腺癌细胞的调节作用仍不清楚。本课题包括以下三部分:第一部分:Gal-1和MDR1在乳腺肿瘤组织和细胞系中的表达;第二部分:Gal-1敲低对乳腺癌耐药细胞系MCF-7/PTX和MCF-7/ADR中PTX和ADR的敏感性的影响;第三部分:Gal-1敲低增强乳腺癌耐药细胞系MCF-7/PTX和MCF-7/ADR对PTX和ADR的敏感性的机制。第一部分Gal-1和MDR1在乳腺肿瘤组织和细胞系中的表达方法1.通过real-time PCR的方法分别检测乳腺癌肿瘤组织以及正常组织中Gal-1和MDR1的mRNA表达水平。2.通过real-time PCR分析检测人乳腺上皮细胞系（MCF-10A）和乳腺癌细胞系人乳腺癌细胞系（MCF-7）以及其对应的耐药株MCF-7/ADR和MCF-7/PTX中Gal-1和MDR1的mRNA表达水平。3.通过western blot分析的方法检测人乳腺上皮细胞系（MCF-10A）和乳腺癌细胞系人乳腺癌细胞系（MCF-7）以及其对应的耐药株MCF-7/ADR和MCF-7/P TX中Gal-1和P-糖蛋白（P-gp）的蛋白的表达水平。结果1.与正常组织相比,乳腺癌肿瘤组织中Gal-1和MDR1的mRNA表达水平均出现上调,而且二者的表达呈正相关。2.与人乳腺上皮细胞系MCF-10A相比,乳腺癌细胞系MCF-7中Gal-1和MDR1的mRNA表达水平均出现显著上调,此外,与乳腺癌细胞系MCF-7的亲本株相比,乳腺癌细胞系MCF-7的耐药株MCF-7/ADR和MCF-7/PTX中Gal-1和MDR1的mRNA表达水平进一步增加。3.与人乳腺上皮细胞系MCF-10A相比,乳腺癌细胞系MCF-7中Gal-1和P-糖蛋白（P-gp）的蛋白表达水平均出现显著增加,此外,与乳腺癌细胞系MCF-7的亲本株相比,乳腺癌细胞系MCF-7的耐药株MCF-7/ADR和MCF-7/PTX中Gal-1和P-糖蛋白（P-gp）的蛋白表达水平进一步增加。第二部分Gal-1敲低对乳腺癌耐药细胞系MCF-7/PTX和MCF-7/ADR中PTX和ADR的敏感性的影响方法1.通过M T T实验的方法检测乳腺癌细胞系M C F-7以及其耐药细胞系MCF-7/ADR和MCF-7/PTX细胞的存活率。2.通过 westernblot 的方法检测 Gal-1 在转染 siRNA-Gal-1 和 siRNA-Gal-2 的ADR和PTX耐受的乳腺癌细胞系MCF-7/ADR和MCF-7/PTX中的表达。3.通过MTT细胞活性实验检测Gal-1敲低对ADR和PTX耐受的乳腺癌细胞系MCF-7/ADR和MCF-7/PTX细胞活性的影响。4.通过流式细胞术的实验方法检测Gal-1敲低对ADR和PTX耐受的乳腺癌细胞系MCF-7/ADR和MCF-7/PTX细胞凋亡的影响。结果1.MTT实验结果表明,与乳腺癌细胞系MCF-7的亲本株相比,ADR和PTX耐受的乳腺癌细胞系MCF-7/ADR和MCF-7/PTX的细胞活性显著增加。2.Western blot结果证实,与Con siRNA对照组相比,Gal-1在转染siRNA-G al-1和siRNA-Gal-2的ADR和PTX耐受的乳腺癌细胞系MCF-7/ADR和MCF-7/PTX中中出现低表达。3.MTT实验结果显示,Gal-1敲低或（PTX或ADR）处理导致细胞活力的明显降低;此外,与单独化疗组相比,在MCF-7/PTX和MCF-7/ADR细胞中,Gal-1敲低与PTX或ADR的组合导致更低的细胞活力。4.流式细胞术实验结果显示,Gal-1敲低或（PTX或ADR）处理导致细胞凋亡的显著增加,此外,与单独化疗组相比,在MCF-7/PTX和MCF-7/ADR细胞中,Gal-1敲低与PTX或ADR的组合诱导更高的细胞凋亡。第三部分Gal-1敲低增强乳腺癌耐药细胞系MCF-7/PTX和MCF-7/ADR对PTX和ADR的敏感性的机制方法1.利用Western blot分析的方法检测转染siRNA-Gal-l和pcDNA-MDR1的乳腺癌细胞系MCF-7/PTX和MCF-7/ADR中P-gp蛋白的表达。2.通过MTT细胞活性实验检测Gal-1敲低或MDR1过表达对ADR和PTX耐受的乳腺癌细胞系MCF-7/ADR和MCF-7/PTX细胞活性的影响。3.通过流式细胞术的实验方法检测Gal-1敲低或MDR1过表达对ADR和PTX耐受的乳腺癌细胞系MCF-7/ADR和MCF-7/PTX细胞凋亡的影响。4.通过 westernblot 分析确定 siRNA-Gal-1 和 siRNA-Gal-2 对 ADR 和 PTX 耐受的乳腺癌细胞系MCF-7/ADR和MCF-7/PTX中Raf-1/AP-1信号通路相关蛋白p-Raf-1（Ser338）,Raf-1,p-c-Jun（Ser73）,c-Jun和c-Fos的表达的影响。5.通过 westernblot 分析确定 Raf-1siRNAs 和 Raf-1抑制剂 GW5074对 ADR 和 PT X耐受的乳腺癌细胞系MCF-7/ADR和MCF-7/PTX中Raf-1/AP-1信号通路相关蛋白以及P-gp蛋白表达的影响。6.通过MTT细胞活性实验检测Raf-1 siRNA1（GW5074）或Raf-1 siRNA1（GW5074）+pcDNA-MDR1处理对PTX和ADR耐受的乳腺癌细胞系MCF-7/PTX和MCF-7/ADR细胞活性的影响。7.通过流式细胞术的实验方法检测Raf-1siRNA1（GW5074）或Raf-1siRNA1（GW5074）+pcDNA-MDR1处理对PTX和ADR耐受的乳腺癌细胞系MCF-7/PTX和MCF-7/ADR细胞凋亡的影响。结果1.We stern blot分析表明,与相应的对照组相比,Gal-1 siRNA1和Gal-1 siRNA2均显著降低MCF-7/PTX和MCF-7/ADR细胞中P-gp的水平,而过表达MDR1 则减轻了 Gal-1 siRNA1 或 Gal-1 siRNA2 对 P-gp 的抑制作用。2.MTT测定显示,与（Con siRNA+药物）组相比,Gal-1 siRNA1和PTX或Gal-1 siRNA1和ADR的组合显著抑制MCF-7/PTX和MCF-7/ADR细胞的相对细胞活力,过表达MDR1逆转Gal-1敲低对MCF-7/PTX和MCF-7/ADR细胞活性的抑制作用。3.流式细胞术的实验结果显示,与（Con siRNA+药物）组相比,Gal-1 siRNA1和PTX或Gal-1siRNA1和ADR的组合显著促进MCF-7/PTX和MCF-7/ADR细胞的凋亡,过表达MDR1逆转Gal-1敲低对MCF-7/PTX和MCF-7/ADR细胞凋亡的诱导作用。4.Westernblot分析表明,与ConsiRNA组相比,Gal-1siRNA1和Gal-1siRNA2显著降低了MCF-7/PTX和MCF-7/ADR细胞中p-Raf-1（Ser338）,p-c-Jun（Ser73）,c-Jun及c-Fos的表达水平。5.Western blot分析表明,与对照组相比,Raf-1siRNA1和Raf-1siRNA2显著降低了P-gp,p-Raf-1（Ser338）,Raf-1,p-c-Jun（Ser73）,c-Jun和c-Fos在MCF-7/PTX细胞中的表达。此外,Raf-1抑制剂GW5074显著降低MCF-7/ADR细胞中P-gp,p-Raf-1（Ser338）,p-c-Jun（Ser73）,c-Jun和c-Fos的水平。6.MTT测定显示,与（ConsiRNA+药物）组相比,Raf-1 siRNA1和PTX或GW5074和ADR的组合显著抑制MCF-7/PTX和MCF-7/ADR细胞的相对细胞活力,过表达MDR1逆转Gal-1敲低对MCF-7/PTX和MCF-7/ADR细胞活性的抑制作用。7.流式细胞术的实验结果显示,与（ConsiRNA+药物）组相比,Raf-1 siRNA1和PTX或GW5074和ADR的组合显著促进MCF-7/PTX和MCF-7/ADR细胞的凋亡,过表达MDR1逆转Gal-1敲低对MCF-7/PTX和MCF-7/ADR细胞凋亡的诱导作用。结论1.Gal-1和MDR1在乳腺癌组织和乳腺癌细胞系中均呈现高表达。2.Gal-1敲低增强MCF-7/PTX和MCF-7/ADR细胞中PTX和ADR的敏感性。3.过表达MDR1逆转Gal-1敲低诱导的MCF-7/PTX和MCF-7/ADR细胞对PTX和ADR的敏感性。4.Gal-1敲低通过抑制Raf-1/AP-1信号通路减少P-糖蛋白表达以增强对PTX和ADR的敏感性。