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目的:胚胎着床是生殖的关键步骤,决定妊娠成功与否,研究其机制将有助于解决诸多问题,如不孕症诊断和治疗、提高辅助生殖成功率以及寻求新生殖调控手段等。环状RNA（circular RNA,circRNA）是一类新发现的呈共价闭合环状的内源性非编码RNA（non-coding RNA,ncRNA）。作为竞争性内源RNA（competing endogenous RNA,ce RNA）,circRNA可以通过互补碱基配对海绵吸附微小RNA（micro RNA,miRNA）,减弱miRNA对靶基因抑制,从而提高靶基因表达。研究表明circRNA在病理、生理过程中扮演着重要的角色,然而它们在胚胎着床中的具体的作用尚不清楚。本研究旨在揭示小鼠妊娠第5天（Day5,D5）胚胎着床点和着床旁的子宫内膜组织circRNA表达谱,筛选出差异表达circRNA,并通过探讨其功能及可能的调控机制,为探寻胚胎着床的机制提供新思路。方法:1.circRNA芯片分析与验证（1）采用Arraystar circRNA芯片分析小鼠妊娠D5胚胎着床点和着床旁子宫内膜组织circRNA的表达。（2）运用RT-qPCR对随机挑选的4个差异表达circRNA进行验证。2.差异表达circRNA的生物信息学分析（1）circRNA芯片分析数据结合课题组前期同一时间点子宫内膜组织RNA-Seq数据,获得差异表达的circRNA、miRNA和mRNA,运用生物信息学方法构建circRNA—miRNA—mRNA负调控网络。（2）差异表达circRNA的亲本基因进行GO（Gene Ontology）功能分析和KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes）通路分析。（3）circRNA—miRNA—mRNA负调控网络中的基因进行GO功能分析和KEGG通路分析。3.circFoxo3在早孕小鼠子宫内膜蜕膜化中的作用研究（1）以circFoxo3为研究对象,构建小鼠早期妊娠模型、体内人工诱导蜕膜化模型以及子宫内膜基质细胞体外诱导蜕膜化模型,利用RT-qPCR分析circFoxo3的表达规律。（2）circFoxo3在子宫内膜基质细胞蜕膜化中的作用:利用过表达质粒载体转染基质细胞上调circFoxo3表达,体外诱导蜕膜化后,应用RT-qPCR和F-actin染色检测细胞中蜕膜化标志分子Hoxa10表达以及细胞形态变化。（3）circFoxo3与下游miRNA—mRNA的预测与验证:采用Target Scan和miRanda数据库预测与circFoxo3具有结合位点的miRNA;采用micro T、Pictar、miRmap、Target Scan数据库预测与miR-138-5p具有结合位点的mRNA,与课题组前期同一时间点子宫内膜组织RNA-Seq数据分析获得的表达显著下调的mRNA取交集,筛选出与miR-138-5p可能具有调控关系的mRNA,利用双荧光素酶报告基因方法验证两者之间的靶向结合。（4）利用过表达质粒载体转染基质细胞上调circFoxo3表达,体外诱导蜕膜化后,利用RT-qPCR和western blot检测细胞中miR-138-5p、Klf11蛋白表达。（5）利用miR-138-5p mimic转染基质细胞上调miR-138-5p表达,体外诱导蜕膜化后,利用western blot检测细胞中Klf11蛋白表达。（6）Klf11在子宫内膜基质细胞蜕膜化中的作用:利用western blot检测子宫内膜基质细胞体外诱导蜕膜化后Klf11蛋白的表达;利用过表达质粒载体转染基质细胞上调Klf11表达,体外诱导蜕膜化,应用RT-qPCR和F-actin染色检测细胞中蜕膜化标志分子Hoxa10的表达以及细胞形态变化。结果:1.circRNA芯片分析及验证（1）通过Array circRNA芯片检测,在小鼠妊娠D5胚胎着床点和着床旁子宫内膜组织中共发现176个差异表达的circRNA,其中在着床点组织表达显著上调的circRNA 101个,表达显著下调的circRNA 75个（FC≥1.5,P<0.05）。（2）对4个差异表达的circRNA进行RT-qPCR检测,结果显示circRNA＿008885和circRNA＿013924在着床点组织表达上调而circRNA＿21887和circRNA＿004122在着床点组织表达下调,RT-qPCR结果与芯片结果一致,证实了芯片结果的可靠性。2.差异表达circRNA的生物信息学分析（1）构建的circRNA—miRNA—mRNA负调控网络,包含了21个表达显著下调的circRNA（circRNA＿22444、circRNA＿19529、circRNA＿27282等）、14个表达显著上调的miRNA（miR-17-5p、miR-20a-5p、miR-361-5p等）和79表达显著下调的mRNA（actr8、lad1、sv2b等）。（2）对差异表达circRNA亲本基因进行GO分析和KEGG通路分析。GO功能分析包括生物学过程（Biological process,BP）、分子功能（Molecular fuction,MF）和细胞组成（Cellular component,CC）三个亚组分析,BP最显著富集GO条目包括磷酸化、组蛋白H4脱氧乙酸化、组蛋白H3脱氧等;MF包括蛋白质结合、核苷酸结合、ATP结合等;CC包括细胞质、细胞核、复制叉等。最显著富集的KEGG信号通路包括子宫内膜癌、甲状腺激素信号通路、致心律失常性右室心肌病等。（3）对构建的circRNA—miRNA—mRNA负调控网络中79个基因进行GO分析和KEGG通路分析。BP最显著富集GO条目包括蛋白激酶B活化、线粒体细胞色素C释放的正调节、高密度脂蛋白颗粒应答等;MF包括跨膜受体蛋白酪氨酸激酶活性、磷脂酰肌醇2激酶结合、磷脂转运活性等;CC包括细胞膜整体成分、细胞膜、细胞内膜结合细胞器等。最显著富集的KEGG信号通路包括Rap1信号通路、醛固酮调节的钠再吸收、PI3K-Akt信号通路等。3.circFoxo3在早孕小鼠子宫内膜蜕膜化中的作用研究（1）在小鼠早期妊娠模型中,circFoxo3在妊娠D5、D6、D7子宫内膜着床点的表达显著低于着床旁;在小鼠体内人工诱导蜕膜化模型中,蜕膜诱导侧circFoxo3表达显著低于对照侧;在子宫内膜基质细胞体外诱导蜕膜化模型中,诱导蜕膜化后基质细胞中circFoxo3表达显著降低。（2）circFoxo3表达上调抑制子宫内膜基质细胞蜕膜化:利用过表达质粒载体转染上调基质细胞circFoxo3表达,体外诱导蜕膜化后,RT-qPCR检测显示蜕膜化标志分子Hoxa10表达显著降低,F-actin染色观察细胞形态发现细胞蜕膜化受损。（3）circFoxo3与下游miRNA—mRNA的预测与验证:生物信息学预测circFoxo3与miR-138-5p存在结合位点。miR-138-5p与Klf11存在结合位点,双荧光素酶报告基因方法证实两者之间具有靶向结合。（4）利用过表达载体转染基质细胞上调circFoxo3表达,RT-qPCR和western blot结果显示蜕膜化后细胞中miR-138-5p的表达显著降低,而Klf11蛋白表达显著升高。（5）利用miR-138-5p mimic转染基质细胞上调miR-138-5p表达,western blot结果显示蜕膜化后细胞中Klf11蛋白表达显著降低。（6）Klf11表达上调抑制子宫内膜基质细胞蜕膜化:基质细胞体外诱导蜕膜化后,Western blot检测发现细胞中Klf11蛋白表达显著降低。利用过表达质粒载体转染上调基质细胞Klf11表达,体外诱导蜕膜化后,RT-qPCR检测显示细胞中蜕膜化标志分子Hoxa10表达显著降低,F-actin染色观察细胞形态发现细胞蜕膜化受损。结论:小鼠妊娠D5胚胎着床点与着床旁子宫内膜组织呈现差异的circRNA表达谱;circFoxo3参与子宫内膜基质细胞蜕膜化,其机制有待于进一步探讨。