不良妊娠结局（Adverse Pregnancy Outcome,APO）泛指所有围产期不良环境、遗传等因素对妊娠母体、胎儿造成的异常结果。主要包括宫内发育迟缓、流产、胎儿生长受限等各种出生缺陷类型。妊娠前及妊娠期,为满足胎儿迅速的生长发育需求,以及维持妊娠母体自身活跃的代谢,妊娠期妇女对营养素要求增多。维生素是维持生命的一类微量物质,俗称维他命,以“生物活性物质”的形式参与维持和调控机体的多种生理功能和代谢过程。机体自身无法合成维生素,需从日常饮食中摄取。叶酸（维生素B9）是人和动物不可或缺的一种水溶性B族维生素,作为嘌呤嘧啶代谢中的必要因子,参与了机体内脱氧核糖核酸（DNA）的合成、蛋白质合成、细胞分裂等重要的生理过程。现有研究表明,妊娠过程中母体叶酸缺乏是导致胎儿神经管缺陷（Neural Tube Defects,NTDs）的关键因素。母体在妊娠前以及围产期,特别是胎儿神经管形成和发育的重要时期补充叶酸,能够切实有效的降低无脑儿、脊柱裂、唇腭裂等出生缺陷的发生率。众所周知,哺乳动物的妊娠过程复杂而精密,涉及到子宫内膜容受性建立、胚胎着床、子宫内膜蜕膜化、胚胎发育和分娩等众多阶段。子宫内膜基质细胞的蜕膜化过程（decidualization）是指在胚胎成功着床之后,子宫内膜的基质细胞开始增殖、分化的过程。目前,大多数研究均从胎儿自身的生长发育视角,探讨叶酸缺乏导致不良妊娠结局的发生机制;而很少从母体角度寻找其可能机理。鉴于蜕膜化的正常进行是维持胚胎正常生长发育的基本条件,同时妊娠前及妊娠期母体的叶酸水平对于妊娠建立和维持也具有重要意义。我们首次关注了叶酸缺乏对母体子宫内膜功能的影响。我们已发表的研究结果表明:妊娠母体体内叶酸缺乏不影响孕鼠子宫内膜容受性的建立,胚胎能够正常着床,但叶酸缺乏孕鼠的胎儿出生率显著下降,导致不良妊娠结局的发生。因此,母体叶酸缺乏可能通过影响胚胎着床以后的妊娠维持而导致出生缺陷的发生。本研究将在前期研究的基础上,重点探讨叶酸缺乏如何导致胚胎着床后子宫内膜蜕膜化异常,从孕早期母体子宫内膜功能维持的角度来寻找叶酸缺乏导致不良妊娠结局的可能机制。本课题的主要研究内容和结果如下:1.成功构建叶酸缺乏的动物模型和蜕膜细胞模型动物模型:小鼠予以叶酸缺乏饲料饲喂后,采用电化学发光法测定血清中叶酸及其代谢产物（HCY、SAM、SAH）水平,结果显示叶酸缺乏孕鼠中叶酸及其代谢产物水平显著降低。将其与正常成年雄鼠合笼后,收集子宫内膜蜕膜化关键时期,即妊娠第6至8天（D6-D8）孕鼠子宫内膜组织。蜕膜细胞模型:体外分离叶酸缺乏小鼠的子宫内膜基质细胞,免疫荧光法检测在分离的细胞中基质细胞标志性分子波形蛋白vimentin显著表达,基质细胞分离成功。雌激素E2和孕酮P4体外诱导蜕膜化,Real-time PCR法检测显示蜕膜化指标分子dtprp显著升高,小鼠原代基质细胞体外诱导蜕膜化成功。进一步采用不含叶酸的培养基进行培养,构建叶酸缺乏蜕膜细胞模型。2.探讨叶酸缺乏对小鼠子宫内膜蜕膜化进程的影响在叶酸缺乏的动物模型和蜕膜细胞模型中,采用Real-time PCR和Western Blot方法检测蜕膜化标志因子Bmp2、Mmp2、Mmp9、Hoxa10、PR的基因和蛋白表达情况。结果显示,叶酸缺乏组中以上因子的表达水平均显著低于对照组。提示,叶酸缺乏抑制小鼠子宫内膜的蜕膜化进程。3.在叶酸缺乏抑制的子宫内膜蜕膜化进程中,自噬发挥作用自噬是一种维持细胞内环境稳态的“自我清除”途径,参与调控雌性正常生殖功能。研究发现,在雌性哺乳动物中,自噬调控子宫内膜功能、参与卵巢原始卵泡的形成、影响胚胎的发育。异常的细胞自噬可增强子宫内膜癌的侵袭能力,促进子宫内膜异位症的进展。这些研究均提示,自噬对于维持子宫内膜的正常功能方面具有重要作用。因此,我们重点关注了自噬在叶酸缺乏引起的子宫内膜蜕膜化异常过程中的作用。在叶酸缺乏的动物模型和蜕膜细胞模型中,检测自噬水平的变化。研究发现叶酸缺乏组中,电子显微镜法检测到自噬小体数量减少;免疫荧光、Real-time PCR和Western Blot方法观察到自噬标志分子LC3的表达显著减少。表明叶酸缺乏可抑制小鼠子宫内膜细胞总自噬水平。进而在对自噬各个环节的检测中,Real-time PCR和Western Blot结果显示,叶酸缺乏组中自噬体形成的标志分子Atg5、Atg12、Atg3、Atg16、Atg7的表达水平均降低,表明叶酸缺乏抑制了自噬小体的形成。其次,叶酸缺乏组中溶酶体膜上标志因子Lamp2的m RNA及蛋白表达水平均降低,说明叶酸缺乏阻碍了自噬小体与溶酶体的融合过程。最后,叶酸缺乏组中溶酶体组织蛋白酶Cathepsin B、Cathepsin L的m RNA及蛋白表达水平也显著减少,提示叶酸缺乏时自噬溶酶体对内容物的降解减少。此外,将m Cherry-GFP-LC3质粒转入小鼠子宫内膜基质细胞并诱导蜕膜化;利用荧光显微镜观察到,与对照组相比,叶酸缺乏组中绿色信号并没有减弱,证实叶酸缺乏抑制了自噬体与溶酶体的融合,干扰了自噬流。以上结果表明,在叶酸缺乏导致的子宫内膜蜕膜化异常的过程中,细胞自噬水平发生改变,且自噬体形成、自噬体与溶酶体融合、内容物降解各个阶段均受到不良影响。4.叶酸缺乏通过抑制自噬,导致子宫内膜蜕膜化异常为了验证自噬参与了叶酸缺乏导致的子宫内膜蜕膜化异常这一过程,在叶酸缺乏的动物和蜕膜细胞模型中,利用特异性自噬抑制剂3-MA成功抑制自噬、自噬诱导剂雷帕霉素成功诱导自噬后,进一步检测小鼠子宫内膜中蜕膜化相关指标的变化情况。Western Blot检测结果显示,与叶酸缺乏组比较,叶酸缺乏联合3-MA干预后,自噬标志性蛋白LC3、Atg5、Beclin1的表达水平进一步降低;而叶酸缺乏联合雷帕霉素干预后,以上蛋白表达均升高;表明自噬干预模型构建成功。在此基础上,对妊娠第6天胚胎植入点数的统计结果显示,与对照组相比较,叶酸缺乏组胚胎植入点数明显减少,3-MA使其进一步减少,而雷帕霉素使减少的植入点数得到一定程度的恢复。同时,雷帕霉素使叶酸缺乏抑制的蜕膜化标志蛋白Hoxa10、Bmp2、Mmp2的表达得到一定程度的回升;而3-MA则加重了叶酸缺乏对蜕膜化的抑制。同时,通过免疫共沉淀法（Co-IP）检测到在妊娠蜕第6、7天的孕鼠子宫内膜组织中,蜕膜化标志蛋白Hoxa10与自噬标志蛋白Cathepsin L具有相互作用,而叶酸缺乏时两者间的蛋白质相互作用减弱。以上结果证实,叶酸缺乏通过抑制自噬,导致子宫内膜蜕膜化异常。5.叶酸缺乏通过抑制AMPK/mTOR信号通路,下调自噬,导致子宫内膜蜕膜化进程异常。AMPK和mTOR在细胞营养和能量状况调控中发挥作用。作为细胞内两种不可或缺的中枢激酶复合体,参与调控细胞生长和代谢等。当能量缺乏时,AMPK发生磷酸化,从而抑制mTOR。已知,AMPK/mTOR信号通路是调节细胞自噬的经典信号通路,同时也参与维持早期妊娠过程中子宫内膜的正常功能。因此,在自噬参与的叶酸缺乏所致的小鼠子宫内膜蜕膜化异常这一过程中,我们探讨了AMPK/mTOR信号通路的作用。动物和细胞模型中Western Blot检测结果显示,与对照组相比较,叶酸缺乏组中AMPK/mTOR标志蛋白p-AMPK、p-4E-BP1的表达下降;p-mTOR、p-S6K1的蛋白表达上调。表明叶酸缺乏激活了AMPK的磷酸化,使其对mTOR的抑制减弱,促使mTOR激活。为了探讨AMPK/mTOR信号通路是否参与了叶酸缺乏所导致的子宫内膜自噬异常这一过程,在体内和体外实验中,利用mTOR抑制剂雷帕霉素干预AMPK/mTOR信号通路。Western Blot方法检测结果显示,被叶酸缺乏抑制的自噬标志蛋白LC3、Atg5、Beclin1的表达水平得到回升;同时,被叶酸缺乏下调的蜕膜化标志蛋白Hoxa10、Bmp2、Mmp2的表达水平升高。以上结果表明,叶酸缺乏通过抑制AMPK/mTOR,下调自噬,导致子宫内膜蜕膜化过程异常。我们首次以自噬紊乱的角度探讨了叶酸缺乏导致子宫内膜蜕膜化异常的机制,既扩展了对自噬功能的认识,同时为完善叶酸缺乏致胎儿出生缺陷的分子机制研究提供了新思路。结论:本研究通过构建叶酸缺乏动物模型和叶酸缺乏子宫内膜蜕膜细胞模型,从胚胎着床后母体子宫内膜蜕膜化的角度系统研究了叶酸缺乏导致不良妊娠结局的作用机制。我们首次提出叶酸缺乏可诱发子宫内膜蜕膜细胞自噬紊乱,影响子宫内膜蜕膜化进程,导致不良妊娠结局的发生;其作用的分子机制与AMPK/mTOR信号通路的调控密切相关。本研究立足营养和妊娠建立与维持,以细胞自噬为切入点,深入探讨叶酸缺乏对子宫内膜蜕膜化的不良影响,既丰富了对自噬功能的理解,同时也完善了从孕早期母体的角度对叶酸缺乏致胎儿出生缺陷发生机制的认识,为出生缺陷的病因诊断和预防研究提供了新靶点和新视角。