AcMNPV感染悬浮培养Sf9细胞动力学参数的测定及影响因素的研究

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杆状病毒表达载体系统作为最具发展前景和应用价值的表达载体系统之一,被广泛用于重组蛋白的生产、疫苗的研制以及制备生物杀虫剂。但由于杆状病毒感染过程十分复杂,现阶段又没有一个准确的、有效的感染动力学数学模型来模拟这一过程,从而给工业化生产带来了诸多不便。建立一个准确的病毒感染动力学模型,需要精确测定这一过程中的各项参数。而细胞周期与细胞生长时间对病毒复制能力也有着非常重要的影响。建立准确的病毒感染动力学模型,必需把这两个因素加入到模型中,因此本论文也对这两个因素对病毒复制能力的影响做了较为深入的研究。本论文用SYBR Green Ⅰ荧光染料对自由病毒DNA进行染色;用抗GP64蛋白的单克隆抗体(AcV1)结合自由病毒粒子,然后用荧光二抗标记AcV1从而间接标记感染细胞。这样被标记上荧光的病毒与细胞就能用流式细胞仪精确测定病毒滴度和感染细胞百分率。最终得到如下结论:(1)通过对终点稀释法和流式检测法的比较,得到大约5个BV病毒粒子等于1个TCID50感染单位。(2)通过对细胞吸附病毒过程中病毒滴度的减少量和细胞的总量之间的关系得出:一个Sf9细胞的饱和病毒吸附量为50个BV,那么当MOI值大于50BVs/cell时就为高感染。(3)通过对病毒滴度的变化关系得出:细胞吸附病毒的过程要持续6h;在感染后3h,细胞胞吞病毒的速率开始大于细胞吸附病毒的速率。(4)通过对“阴性最高荧光强度分界法”、“阴性曲线与阳性曲线交叉法”和“匹配面积相减法”,这三种分析方法的比较,得出在这三种分析方法中用“匹配面积相减法”来分析感染细胞的百分率是最为准确的。本论文对生长时间、细胞周期对细胞活性和病毒感染能力的影响也进行了研究。生长时间对细胞活性和病毒感染能力的影响是通过采集延滞期、对数生长期和稳定期的细胞,用MTT法研究三个不同时期的细胞活性的强弱关系,并用病毒感染,来确定三个不同时期的细胞被感染后的病毒复制能力的强弱。最终得到如下结论:(1)用MTT法研究延滞期、对数生长期和稳定期这三个不同时期的细胞活性强弱关系,得到细胞活性的关系是:对数生长期>延滞期>稳定期。(2)延滞期、对数生长期和稳定期这三个不同时期的细胞被感染后的病毒复制能力的强弱关系为为:对数生长期>延滞期>稳定期细胞周期对细胞活性和病毒感染能力的影响,首先是用诺考达唑对细胞进行同步化,然后采集初始细胞周期分布不同的细胞(G1期比例最大的细胞、S期比例最大的细胞和G2/M期比例最大的细胞)。实验用MTT法确定三个期的细胞活性的强弱关系为:G1期>S期>G2/M期,得到三个不同期的细胞被感染后的病毒复制能力的强弱关系为:G1期>S期>G2/M期。最后病毒感染对细胞周期也有着显著的影响,当Sf9细胞被AcMNPV病毒感染后,细胞周期会最终阻断并累积在G2/M期。
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