结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,M.tuberculosis,Mtb)是引起人结核病(Tuberculosis,TB)的病原菌。在人类的进化史中始终伴随着与此类病菌的抗争,并与人共同进化不被杀灭。该菌的出现最早可以追溯到5万年前的非洲人时期,并且到目前为止仍然不能被良好的控制和消灭,它可称之为微生物系统中的佼佼者,被世界卫生组织列为全球十大致死性病原之一。结核分枝杆菌之所以难以清除,关键在于其结构的复杂性、分泌系统的特殊性以及进化出的多种逃逸宿主免疫应答的机制。结核分枝杆菌的Ⅶ型分泌系统,是最晚发现的一类分泌系统,也是我们了解最少的一类分泌系统。尽管Ⅶ型分泌系统处理和转运底物的细节还未阐明,但有研究推测,致病性分枝杆菌特有的PE/PPE蛋白很可能由该系统分泌。分枝杆菌属成员众多,但PE/PPE家族仅存在于结核分枝杆菌、非洲分枝杆菌、牛分枝杆菌等具有致病性的分枝杆菌中,推测该家族成员很可能与分枝杆菌的致病性密切相关。PE/PPE家族包含PE和PPE两个亚家族,是分枝杆菌特有的,占结核分枝杆菌基因组容量的10%。PE亚家族蛋白特征是N端具有保守的P(Pro)-E(Glu)氨基酸序列,C端长度不一,不具有统一特征;PPE亚家族蛋白特征是N端具有保守的P(Pro)-P(Pro)-E(Glu)氨基酸序列,大部分成员C端具有特征性基序,少部分成员C端序列同源性很低,无特征性基序。PE/PPE家族蛋白保守的特征性序列可能与蛋白在菌体内的定位和分泌有关,而可变区多样并且易发生变异,这可能与菌体适应宿主环境、感染机体致病相关。巨噬细胞遍布于全身各处,能够捕捉从各种途径入侵的病原体并将其清除,是机体天然免疫系统的一道重要防线。结核分枝杆菌为胞内寄生菌,感染机体后主要寄居在巨噬细胞内,并且能够在巨噬细胞内生存和繁殖并不被杀灭。结核分枝杆菌感染巨噬细胞过程中,与体外培养条件相比,PE/PPE家族蛋白显示出表达量的显著差异。多项研究证明,该家族成员参与构成分枝杆菌细胞壁的结构,作为细菌表面蛋白,通常都在与宿主细胞的互作中发挥关键作用。以上这些发现提示我们,PE/PPE蛋白很可能与分枝杆菌在巨噬细胞内的存活、分枝杆菌的免疫逃逸有相关性。本研究证实了结核分枝杆菌PE/PPE家族的PE17蛋白能够促进耻垢分枝杆菌在巨噬细胞内存活,并增强了耻垢分枝杆菌对巨噬细胞毒性和对小鼠的致病性。首先,我们基于穿梭表达载体pMVTC-C构建了156个超表达结核分枝杆菌H37Rv PE/PPE家族蛋白的重组质粒,分别电转化耻垢分枝杆菌MC~2155菌株(MS),建立了包含144株重组耻垢分枝杆菌的菌株库,接着通过感染小鼠腹腔巨噬细胞的模型,筛选出6株(分别超表达以下6个蛋白:RS23(Rv0124)、RS48(Rv2853)、PE17(Rv1646)、PE30(Rv1651c)、PE35(Rv3872)和PPE8(Rv0355c))在小鼠腹腔巨噬细胞内存活力显著提高的重组耻垢分枝杆菌。之后,我们从中选取了PE17(Rv1646)这一个蛋白,进行后续深入的研究。为了确认PE17蛋白在耻垢分枝杆菌中的亚细胞定位情况,我们构建了超表达PE17蛋白的pAIC-PE17-MS重组耻垢分枝杆菌菌株,差速离心法分级分离菌体的培养滤液(CF)、菌体全细胞裂解产物(WCL)、菌体细胞壁(CW)、菌体细胞质(Cy)和菌体细胞膜(CM),经由Western Blotting检测确定了PE17蛋白定位于耻垢分枝杆菌的胞壁(CW)和胞质(Cy)。为了研究PE17蛋白对耻垢分枝杆菌形态以及在增强耻垢分枝杆菌体内外感染中的作用,我们构建了pMV262-PE17-MS重组耻垢分枝杆菌,菌体特性观察证实,表达的PE17蛋白并不影响耻垢分枝杆菌的菌落和菌体形态以及胞壁的结构。体外感染小鼠腹腔巨噬细胞试验证实,PE17蛋白促进耻垢分枝杆菌在巨噬细胞内的存活作用很可能是微量高效的,它能够抑制小鼠腹腔巨噬细胞促炎因子的释放,引起细胞坏死。静脉注射感染小鼠的体内试验进一步证实,PE17蛋白能够显著延长耻垢分枝杆菌在小鼠体内的存活时间,明显增强耻垢分枝杆菌对小鼠脏器的损伤。同时,感染小鼠体内IFN-γ和IL-1β的含量持续保持在较高水平,预示着菌体难以被机体清除,也部分解释了PE17蛋白的重组耻垢分枝杆菌对脏器损伤力增强这一现象的原因。本试验从144株耻垢分枝杆菌转化株中筛选出了6株能促进在巨噬细胞内存活的菌株,通过细胞感染和小鼠体内感染模型验证了结核分枝杆菌PE17蛋白对结核分枝杆菌致病力的贡献,本研究的开展鉴定了结核分枝杆菌新的毒力因子,为治疗结核的药物研发提供了新的候选靶标,也为结核病防控增添了新的理论依据。