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孔雀石绿(Malachite green,MG)是一种碱性三苯甲烷类染料,在纺织、印刷等行业有广泛应用,而且作为杀寄虫剂和杀真菌剂被世界各地的水产养殖业所利用。然而,孔雀石绿具有致癌毒性,可以在鱼类组织和水体中积累,潜在威胁人类身体健康和破坏生态环境。生物修复具有成本低、环境友好等特点,是可持续的染料污水治理手段。目前,已有多种微生物被证明具有孔雀石绿的脱色活性,但由于在污染环境或水环境下的生长受限,尚不能被应用。相对而言,蓝细菌在水环境中生长,具有不依赖于有机碳源和能源、在光照条件下快速生长繁殖的优点,在环境修复领域受到广泛关注。此外,蓝细菌遗传操作体系简单,利用合成生物学手段在蓝细菌体内重组表达活性酶,有利于在生物吸附和富集染料的基础上,实现内部降解孔雀石绿,提高藻株重复利用率。三苯甲烷还原酶(TMR)是一种将三苯甲烷类染料特异性降解为无色、低毒性小分子的氧化还原酶。我们课题组前期从碱蓬内生细菌Klebsiella aerogenes S27中分离纯化得到新型三苯甲烷还原酶KaTMR,证明该酶可以有效地将孔雀石绿降解为小分子量的低毒性产物,恢复植株在孔雀石绿培养液中的生长,具有生物修复应用潜力。然而,katmr基因在常用工程菌株Escherichia coli BL21中的重组表达产物主要以包涵体形式存在,不利于其工业开发应用。在本项研究中,我们以淡水蓝细菌——聚球藻PCC 7942为研究对象,首次探讨了其对孔雀石绿的脱色活性和分子机制。其次,将katmr基因在聚球藻PCC7942中异源表达,构建了一株能高产可溶性KaTMR活性蛋白的工程蓝细菌PCC7942-KaTMR,对工程菌降解孔雀石绿的功能和机制进行研究。为蓝细菌生物修复孔雀石绿废水提供理论基础。本论文的主要研究内容如下:(1)首次揭示聚球藻PCC 7942对孔雀石绿的有效吸附作用:我们的数据表明,在30℃和pH 6.0条件下,野生型聚球藻PCC 7942在12 h内可使99.5%的孔雀石绿脱色。(2)证明聚球藻PCC 7942通过吸附和富集作用去除孔雀石绿,但不能降解该化合物:HPLC-MS分析表明,孔雀石绿能够进入聚球藻PCC 7942的藻体内,但不发生化学结构的变化。同时,生长曲线表明,孔雀石绿进入聚球藻体内后明显抑制了细胞的生长。(3)成功构建聚球藻工程菌株PCC7942-KaTMR:工程菌过表达可溶性活性蛋白,重组KaTMR产量约为720 mg/L。利用Ni-NTA亲和层析纯化得到重组KaTMR,产量约为120 mg/L。重组KaTMR具有孔雀石绿脱色活性,最适pH为8.0,最适温度为60℃;HPLC-MS分析表明,重组KaTMR在体外将孔雀石绿降解为(4-二甲基氨基-苯基)-苯基-甲酮(m/z 226.98)和去甲基石绿(m/z315.45)。(4)聚球藻工程菌株PCC7942-KaTMR较野生型藻株具有更强的孔雀石绿脱色活性:首先,与野生型相比,工程蓝细菌在低细胞浓度(4.5×10~6 cells/mL)及压力环境下(NaCl 0.9-1.5 M、pH 4-6、温度42℃)也能表现为更高的脱色能力,脱色效率提高了7.7%。其次,在孔雀石绿染料分批补料过程中,工程菌具有更高的可持续脱色能力,在60 h时,工程蓝细菌残留的孔雀石绿浓度为11.4mg/L;野生型为19.1 mg/L。(5)证明工程菌株PCC7942-KaTMR能够降解孔雀石绿,从而阐释了上述优势活性的分子机制:HPLC-MS分析证明,孔雀石绿在进入聚球藻PCC 7942工程菌后被降解为小分子量的产物4-甲基氨基苯甲酸(m/z 152.20)和4-羟基苯胺(m/z 110.06)。(6)聚球藻PCC 7942具有对孔雀石绿污染的水环境的修复潜力:工程菌对孔雀石绿有显著的解毒活性,植物毒性实验表明,与100 mg/L孔雀石绿共同孵育时,小麦种子的发芽率为78.8%,茎不能发育;相比之下,与工程菌处理孔雀石绿的降解产物共同孵育时,种子的发芽率提高到97.7%,茎长达到3.65 cm。综上所述,本次研究首次揭示了聚球藻PCC 7942对孔雀石绿的高效脱色能力,通过重组表达三苯甲烷还原酶(KaTMR酶),进一步增强了其高效可持续脱色和降解孔雀石绿的能力,并能够显著促进孔雀石绿污染环境下植株的生长。该研究成果丰富了蓝细菌在有毒染料及水环境下的生物修复中的应用,对水资源,特别是淡水资源的循环利用具有重要意义。