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目的：
在法医实际鉴定工作中,对缺血缺氧性心肌病变引起的心源性猝死的法医学鉴定一直是困扰法医和病理学界的难题。心肌缺血缺氧性损伤后,往往可致个体在短时内死亡。此类心肌缺血所致心源性猝死案例,发病急骤,死亡迅速,通常缺乏明显的冠状动脉病变及典型的心肌病理形态学所见。而典型病理形态学改变的出现往往在心肌供血完全中断6小时后,才可能通过HE染色观察到。对于无明显冠状动脉及心肌病变的案例,主要是用排除其他死因(如机械性窒息、急性中毒等)的方法来诊断。体内的某些免疫组织化学和生化学指标可在心肌缺血缺氧性损害发生后,数分钟内迅速表达升高,对心肌缺血所致的心源性猝死的法医学诊断有重要意义。本研究主要由两部分构成:动物实验及法医学解剖例检验。第一部分,建立大鼠急性心肌缺血动物模型,观察大鼠缺血期心肌VEGF免疫组织化学染色特点及其表达随时间的变化规律,同时监测其心电图改变。第二部分,选取2种免疫组织化学指标VEGF、Mb和2种生化学指标CK-MB、cTnT,通过38例法医学实际鉴定案例,对比研究VEGF及Mb在缺血性心脏病解剖例心肌中的表达情况,综合分析缺血性心脏病死者心包液中肌酸激酶同工酶(CK-MB)、心肌肌钙蛋白T(cTnT)浓度变化规律,探讨上述因子在心肌缺血的法医学鉴定中的应用价值。
实验材料和方法：
动物实验:健康成年雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠,体重280～300g。适应性饲养1周后,将其随机分为6组,每组9只,其中5组为实验组,1组为正常对照组。通过结扎左冠状动脉前降支,建立大鼠急性心肌缺血模型,通过powerlab监测记录标准第Ⅱ导联大鼠心电改变。分别于手术结扎LAD后15min、30min、1h、3h和6h将大鼠颈椎脱位。处死后,取出大鼠心脏。去除结扎线以上心肌,于结扎线下5mm处,将大鼠心脏横断为两部分,取上半部分心肌,放入4％多聚甲醛固定、制作蜡块,用于HE染色及VEGF免疫组织化学染色。取下半部分心尖部心肌组织,提取蛋白,用于western-blot检测。
解剖例检验:收集中国医科大学法医学院法医病理教研室2008年3月-2010年3月的实际解剖案例,共计38例,其中心肌缺血15例,心肌梗死13例,高坠及交通肇事所引起的多器官损伤10例。参照缺血心脏病分类有关文献,将缺血性心脏病分为以下两组:1.心肌缺血组,大体解剖发现冠状动脉不同程度管腔狭窄,组织学检查可见局部心肌纤维嗜伊红染色增强,但未检见心肌凝固性坏死、心肌间质出血等所见;2.心肌梗死组,组织学检查发现左室前壁有心肌凝固性坏死、心肌问质出血。取左冠状动脉前降支支配区心肌组织,制作蜡块,用于HE染色和VEGF、Mb免疫组织化学染色;取上述案例心包液,采用化学发光免疫测定法(Chemiluminescence immumo-assay,CLIA)测定cTnT、CK-MB浓度。
结果：
动物实验部分:心电监测结果显示,正常对照组大鼠心电未发生改变,实验组大鼠心电图均显示ST段抬高。另有9只大鼠发生致死性心律失常。正常对照组大鼠心肌未见VEGF表达;缺血15min组,缺血区心内膜下可见VEGF弱阳性表达,随着缺血时间的逐渐增加,VEGF的表达逐渐增强。缺血3h组,VEGF广泛表达于缺血区、缺血周边区等心肌细胞及血管内皮细胞。缺血6h组,VEGF表达强度较结扎3h组有所下降。实验组各时间段VEGF变化强度呈规律性变化。对照组,VEGF几乎不表达;从缺血15min开始,VEGF蛋白开始表达,缺血3h组VEGF表达达到高峰,缺血6h组较缺血3h组强度有所下降,但仍处于较高水平。
解剖例检验部分:15例心肌缺血案例及13例心肌梗死案例均在心肌细胞中检出VEGF阳性着色,VEGF的表达部位多位于缺血区或梗死灶周边区,梗死区偶见VEGF阳性颗粒。对照组案例未见阳性反应。15例心肌缺血案例及13例心肌梗死案例除在正常心肌细胞中均检出Mb阳性着色外,缺血区及梗死灶周边区心肌间质中检出Mb阳性着色。对照组案例除在心肌细胞中检见Mb阳性着色外,心肌间质中未见棕黄色的阳性反应。心肌缺血及心肌梗死组心包液中CK-MB、cTnT浓度高于对照组,且VEGF、Mb阳性面积与心包液中CK-MB浓度成正比。相关分析结果显示,心肌梗死和心肌缺血组VEGF、Mb和CK-MB彼此之间存在相关关系。
结论：
1.VEGF对心肌缺血反应敏感,在心肌缺血15分钟后,即可观察到心肌缺血组VEGF开始表达,随着缺血时间延长,VEGF表达增加,于心肌缺血3小时达到高峰;
2.心肌中VEGF、Mb的分布及心包液中CK-MB浓度呈正相关关系,均可反应心肌缺血性损害的程度,VEGF的特异性好于Mb;
3.实验中猝死案例的死亡原因,可能与急性心肌缺血所导致的致死性心律失常有关;
4.免疫组化技术与生化学检测技术联合应用,可以检测出心肌缺血缺氧性损害的部位、程度。