细叶百合LpMYB1与LpMYB11基因的克隆与功能分析

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细叶百合(Lilium pumilum)兼具观赏、食用和药用价值,具有抗盐、抗旱能力,是百合育种的重要亲本。本研究从细叶百合转录组里筛选出23个MYB转录因子(命名为LpMYB1-23),对这些转录因子进行了生物信息学、系统进化树和不同胁迫下的表达模式分析。根据表达模式从中筛选出了表达量变化明显的两个基因进行克隆,并将这两个基因利用农杆菌介导法转入烟草中,比较了盐胁迫下转基因烟草的耐受性,期望筛选出优质的抗盐基因,为百合的抗盐育种奠定基础,对解析细叶百合的抗盐性提供参考。论文主要研究结果如下:1.细叶百合23个MYB蛋白氨基酸数在100-570之间,分子量在11349.89-46229.91k Da之间,等电点为4.85-10.4。蛋白质疏水性在-1.101和0.891之间,绝大多数MYB蛋白质为亲水蛋白质,只有LpMYB2、LpMYB4、LpMYB16为疏水蛋白质。除LpMYB16、LpMYB18为稳定性蛋白质外,其他的均为不稳定蛋白质。LpMYBs氨基酸序列全长序列中共检测出3个保守基序,大多数LpMYBs有三个保守基序且位置相近,其中LpMYB12和LpMYB21只含有一个保守基序,LpMYB18、LpMYB16、LpMYB15、LpMYB13含有两个保守基序。系统进化树分析表明R2R3-MYB类转录因子(包括LpMYB13,LpMYB15,LpMYB16,LpMYB17,LpMYB18,LpMYB19,LpMYB20,LpMYB21,LpMYB22,LpMYB23)主要是分布在Ⅰ类,占细叶百合总R2R3RMYB类转录因子的70%,1R-MYB(包括LpMYB2,LpMYB3,LpMYB4,LpMYB1,LpMYB5,LpMYB6,LpMYB7,LpMYB8,LpMYB9,LpMYB10)主要是分布在Ⅱ类,占细叶百合总1R-MYB类转录因子的50%。1R-MYB类转录因子,结构多样导致其在进化树上分布范围最广。4R-MYB类转录因子(包括LpMYB11,LpMYB12,LpMYB14)主要分布在Ⅰ类。细叶百合MYB蛋白大部分以无规则卷曲为主,其中LpMYB11、LpMYB7、LpMYB15与LpMYB12蛋白是以α-螺旋为主,无规则卷曲、β-折叠以及β-转角分布在蛋白序列中。细叶百合MYB蛋白质三级结构相似性很大,1R-MYB亚族蛋白的三级结构明显比4R-MYB蛋白三级结构复杂。2.23个MYB基因在非生物胁迫(干旱、盐、冷、ABA)胁迫下不同部位(根、茎、叶)的表达模式结果表明,大多数MYB成员能被不同非生物胁迫诱导且在根和叶中明显上调表达,在茎中上调表达的基因较少。3.成功克隆获得LpMYB1和LpMYB11两个基因,LpMYB1开放阅读框长是795bp,编码264个氨基酸,系统进化树分析结果显示其与番木瓜的同源性最高为83.7%;LpMYB11开放阅读框长是516bp,编码171个氨基酸,与大豆的MYB蛋白同源性最高(73.47%)。利用农杆菌介导法将这两个基因分别转入烟草,经过潮霉素抗性筛选和PCR检测,均获得7株阳性植株。亚细胞定位分析表明LpMYB1和LpMYB11均定位在细胞核内。4.转LpMYB1和LpMYB11基因植株抗盐性分析结果表明,盐胁迫下,野生型烟草幼苗的根长和鲜重较转基因烟草变化更大;转LpMYB1和LpMYB11基因烟草中的MDA含量、相对电导率均显著低于对照;转LpMYB1和LpMYB11基因烟草的叶绿素、脯氨酸含量以及抗氧化酶(POD、SOD、CAT)活性均显著高于对照,这些结果表明LpMYB1和LpMYB11基因提高了烟草的耐盐性。
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