目的:上皮性卵巢癌死亡率位居女性生殖道恶性肿瘤第一位，其5年生存率仅为30%～40%，严重威胁妇女健康。导致卵巢癌病人预后差的主要原因是其进展迅速，大部分患者在确诊时已有局部侵润或远处转移，以至于不能获得根治。近年来，肿瘤细胞上皮间质转化（Epithelial-MesenchymalTransition，EMT）、间质上皮转化（Mesenchymal-Epithelial Transition，MET）、微环境与肿瘤细胞的相互作用等被认为与肿瘤的侵袭转移关系密切，成为研究肿瘤侵袭转移机制的热点[1-4]。肿瘤细胞发生EMT后，细胞间黏附减弱，运动能力增强，进而易于突破基底膜发生转移。而缺氧作为实体肿瘤微环境的标志性特征，在实体肿瘤进展过程中普遍存在。本课题将研究缺氧环境下HIF-1α对卵巢癌细胞EMT的诱导及侵袭能力的影响，并进一步探讨应用钙离子拮抗剂能否逆转卵巢癌细胞EMT的发生，从而改变细胞的侵袭能力，旨在从分子水平上探讨缺氧对上皮性卵巢癌细胞发生上皮间质转化及侵袭能力改变的信号转导机制，为上皮性卵巢癌的治疗策略提供实验依据。方法：用含10%胎牛血清RPMI-1640培养基在37℃，饱和湿度5%CO2的培养箱中常规培养人卵巢浆液性囊腺癌细胞株SKOV-3、人卵巢粘液性囊腺癌细胞株3AO。1.倒置相差显微镜：镜下观察常氧和经CoCl²诱导缺氧后SKOV-3和3AO细胞形态学的改变。2.MTT法：将消化后的细胞用含10%胎牛血清的RPMI-1640培养基制成细胞悬液，以每孔5×10⁴密度将细胞接种于96孔培养板中，每孔200μl。待细胞进入对数生长期后用不同浓度CoCl²（25、50、100、150、200μmol/L）作用不同时间（12h、24h、48h），以CoCl²0μmol/L为对照组。采用四甲基偶氮唑蓝（MTT）法检测药物对细胞生长的影响，筛选出药物作用的最适浓度及时间。3.Western blot检测不同浓度CoCl²（25、50、100、150、200μmol/L）作用SKOV-3细胞24h后HIF-1α蛋白的表达，检测50μmol/L的CoCl²作用3AO细胞不同时间（12h、24h、48h）后HIF-1α蛋白的表达。4.Western blot检测SKOV-3和3AO细胞各实验组中HIF-1α蛋白、Twist蛋白、E-cadherin蛋白、N-cadherin蛋白的表达情况。实验分组如下：①Control组：仅以含10%胎牛血清的RPMI-1640细胞培养液培养细胞②CoCl₂组：用100μmol/L的Cocl2作用SKOV-3细胞24h；用50μmol/L的CoCl₂作用3AO细胞24h③VPL组：200μmol/LVPL作用于细胞；④VPL+CoCl₂组：钙离子拮抗剂VPL作用30min后再分别加100μmol/L和50μmol/L的CoCl₂作用于SKOV-3和3AO细胞。5.应用24孔Transwell侵袭小室检测SKOV-3和3AO细胞的侵袭能力，实验分组：①Control组：仅以含10%胎牛血清的RPMI-1640细胞培养液培养细胞;②CoCl₂组：分别用100μmol/L和50μmol/L的CoCl₂作用于SKOV-3和3AO细胞;③钙离子拮抗剂（VPL）组：200μmol/L VPL作用于细胞；④VPL+CoCl₂组：VPL作用30min后再分别加100μmol/L和50μmol/L的CoCl₂作用于SKOV-3和3AO细胞，连续培养24小时后取出Transwell侵袭小室，用4%冰多聚甲醛固定，经HE染色，在高倍镜下计数移至微孔膜下层的细胞，测定细胞的运动和侵袭能力。6.应用SPSS13.0统计软件进行统计学分析。结果：1.缺氧状态可促进上皮细胞向间质细胞的形态转变。本实验采用化学试剂CoC12模拟细胞体外缺氧环境。在倒置相差显微镜下观察可见，CoC12作用细胞后，其增殖活性明显受抑制。细胞形态也开始发生变化：部分细胞伸出伪足，呈多角形。细胞排列紊乱，细胞间连接较疏松;而对照组细胞呈上皮样细胞形态，细胞与细胞间的联系较为紧密。2.MTT结果显示，随着CoC12浓度和作用时间的延长，两种细胞的存活率较对照组明显降低，差异均有统计学意义（均p<0.05）。3.Western blot检测两种细胞中HIF-1α蛋白的表达：（1）取不同浓度（0、25、50、100、150、200μmol/L）的CoC12作用SKOV-3细胞24h后，HIF-1α蛋白相对表达量分别为：0.228±0.017、0.606±0.011、0.936±0.007、1.207±0.18、0.795±0.008、0.445±0.013。各实验组与对照组相比差异均有统计学意义（P<0.05）。且100μmol/L组HIF-1α的表达量高。（2）用浓度为50μmol/L的CoC12作用3AO细胞不同时间（0、12h、24h、48h）后，各组HIF-1α蛋白相对表达量分别为：0.322±0.012、0.534±0.007、1.299±0.017、0.825±0.011，各实验组与对照组相比差异均有统计学意义（P<0.05）。且缺氧24h组HIF-1α的表达量高。4.Western blotting检测各实验组HIF-1α、 Twist、 E-cadherin、N-cadherin蛋白的表达。（1）.SKOV-3细胞的HIF-1α蛋白水平缺氧后（1.195±0.011）明显高于缺氧前（0.244±0.007）（P<0.01）；经VPL干预后其HIF-1α蛋白水平（0.685±0.013）明显降低（P<0.01）；3AO细胞的HIF-1α蛋白水平缺氧后（1.453±0.017）明显高于缺氧前（0.317±0.009）（P<0.01）；经VPL干预后其HIF-1α蛋白水平（0.709±0.012）明显降低（P<0.01）；与对照组相比，常氧下应用VPL处理两种细胞后HIF-1α蛋白水平（0.237±0.005,0.295±0.026）无明显差异（P>0.05）。（2）.经CoCl₂处理后SKOV-3和3AO细胞处于缺氧状态，SKOV-3细胞的Twist蛋白水平缺氧后（1.263±0.010）明显高于缺氧前（0.231±0.012）（P<0.01）；经VPL干预后其Twist蛋白水平（0.584±0.012）显著降低（P<0.01）；3AO细胞的Twist蛋白水平缺氧后（1.107±0.008）明显高于缺氧前（0.203±0.014）（P<0.01）；经VPL干预后其Twist蛋白水平（0.604±0.018）明显降低（P<0.01）；常氧下应用VPL后对两种细胞Twist蛋白水平（0.227±0.021,0.193±0.011）与对照组相比均无明显差异（P>0.05）。（3）.正常和缺氧状态下，SKOV-3细胞E-cadherin蛋白表达的相对值分别为（0.965±0.011，0.226±0.009）（p<0.01）；应用VPL干预后E-cadherin蛋白表达水平明显增高（0.365±0.011）（p<0.05）；3AO细胞E-cadherin蛋白表达的相对值分别为（0.795±0.012，0.163±0.005）（p<0.01）；应用VPL干预后E-cadherin蛋白表达水平明显增高（0.359±0.003）（p<0.05）。与对照组相比，常氧下应用VPL处理两种细胞后E-caherind蛋白水平（0.872±0.021,0.789±0.008）无明显差异（P>0.05）。（4）正常和缺氧状态下，SKOV-3细胞N-cadherin蛋白表达的相对值分别为（0.294±0.007，0.954±0.013）（p<0.01）；应用VPL干预后N-cadherin蛋白表达水平与缺氧后相比明显减少（0.527±0.016）（p<0.05）；3AO细胞N-cadherin蛋白表达的相对值分别为（0.176±0.009，0.866±0.013）（p<0.01）；应用VPL干预后N-cadherin蛋白表达水平缺氧后相比明显减少（0.594±0.021）（p<0.05）；常氧下应用VPL后对两种细胞N-cadherin蛋白水平（0.304±0.008,0.164±0.007）与对照组相比均无明显差异（P>0.05）。5.细胞侵袭实验结果加入CoC1²进行缺氧诱导后SKOV-3和3AO细胞的侵袭迁移能力（108±17，131±20）较常氧下明显增强（23±5，16±4）（P<0.01）；加入VPL干预后两株细胞的侵袭迁移能力（53±7，49±11）都明显下降（P<0.01）；而常氧下单独应用VPL对两种细胞的侵袭转移能力（18±5，12±3）无明显影响（P>0.05）。结论：1. CoC1²能够体外为SKOV-3和3AO细胞创造缺氧环境，诱导HIF-1α蛋白表达。2.缺氧环境下，HIF-1α蛋白的高表达可促进细胞中Twist蛋白表达上调，进而诱导细胞发生上皮间质转化，调节标志蛋白的表达（E-cadherin蛋白的表达下调，N-cadherin蛋白的表达上调），增强细胞的侵袭转移能力。3.肿瘤缺氧信号传导通路与第二信使钙信号相互交联，阻断钙信号转导途径，可下调HIF-1α蛋白的表达，逆转卵巢癌SKOV3和3AO细胞发生上皮间质转化，进而减弱细胞的侵袭转移能力。4.缺氧，钙信号与肿瘤细胞的发生发展及侵袭转移能力有关。