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目的：
建立大鼠肝移植术后肠内营养支持模型；调查肠内营养和FK506在原位肝移植术后发生急性排斥反应的大鼠中，其外周血单个核细胞(PBMC)细胞因子IL-2、IFN-γ、IL-10、TGF-βmRNA表达，探讨肝移植后细胞因子谱的改变，以及肠内营养与FK506对细胞因子谱的影响和相互间的关系。
方法：
1.大鼠原位肝移植(ROLT)模型的建立与稳定
1)实验动物
供体：清洁级Wistar大鼠，雌雄不限，体重280～300g。
受体：清洁级SD大鼠，体重250～300g。
2)实验用套管
门静脉、肝下下腔静脉套管：硬质的聚乙烯管经火焰软化后拉制而成；胆管支撑管：硬膜外导管拉制而成。
3)手术过程
改良二套管法
供体手术：要点一缩短热缺血时间，减少安置套管机械性损伤和操作难度供肝的修整及套管：要点-0-4℃的平衡液冰浴中进行
受体手术：要点-顺序开放供、受体的肝下下腔静脉，开放前排除受体肝下下腔静脉血栓
2.ROLT后急性排斥反应的肝脏病理演变
确定Wistar→SD移植方向是否具有较高的免疫原性?供肝是否出现急性排斥反应的病理损伤?
1)标本来源：Wistar→SD的原位肝移植大鼠模型，于术后d1、d2、d3、d5、d7、d8、d9、d11、d15、d21、d40、d60随机处死大鼠，取移植肝脏组织。
2)病理切片制取：苏木精-伊红(HE)染色，倒置显微镜下观察并照相取样
3)病理评价标准：1995年国际肝脏移植排异分级会议制定的标准
4)病理评分：病理特征评定，生成急性排斥活动指数RAI(RejectionActivityindex)，总分0～9分，绘制RAI-时间曲线图。
3.肠内营养支持模型的建立和随机分组
1)肠内营养制剂及免疫抑制剂：
安素(Ensure，EN)终浓度：2Kcal/mlFK506胶囊(FK)：1mg/粒，终浓度：0.266mg/ml
2)随机分组：
对照组(control)、免疫抑制组(FK)、营养支持组(EN)、免疫抑制+营养支持组(FN)
4.安素和FK506对肝移植大鼠排斥反应的影响
1)标本采取：术后7d脱颈处死，取外周血。
2)PBMCs分离：Ficoll密度梯度离心
3)细胞总RNA的提取：华舜公司“小量细胞总RNA快速抽提纯化试剂盒”说明书程序
4)RNA的鉴定与定量
琼脂糖凝胶电泳，检测OD260、OD280，计算RNA浓度
5)RT-PCR检测细胞因子mRNA表达
A、引物设计：根据基因库中的序列，利用PrimerPremier5.0软件设计基因专一性的引物
B、逆转录PCR检测
QIAGEN公司的“OneStepRT-PCRKit”试剂盒说明书程序
结果：
1.50例大鼠肝移植模型稳定存活。24小时存活率84.0％(42/50)；1周存活率82.0％(41/50)。
2.急性免疫排斥反应术后1～5d处于上升期，5～7d达到高峰并维持至15d左右。
3.各组细胞因子mRNA的表达
1)IL-2:control、EN组间无差异；FK、FN二组显著低于control组(p=0.003，p=0.001)。
2)IL-10:control、EN组间无差异，IL-10的表达均处于较高水平，与FK、FN组显著差异(p＜0.01)；FN、FK组间显著差异(p=0.013)
3)TGF-β：control、EN组间无差异，FK、FN组间无差异。FK、FN组与control、EN组显著差异(p＜0.01
4)IFN-γ：control、EN组间无统计差异。FN、FK组与control、EN组显著差异(p＜0.01)；FN、FK组间显著差异(p=0.013)
本文对二套管法作了相应的改进，缩短了肝移植的手术时间，使操作更简单，无须手术显微镜，术后成活率高。在此基础上建立的Wistar→SD大鼠肝移植模型具有较高的免疫原性，可在术后一周左右出现急性排斥反应的高峰，可作为理想的观察的节点。通过简单的灌胃针，可以满足大鼠术后用药和肠内营养支持的需要。术后一周检测外周血单个核细胞Th1和Th2型细胞因子mRNA表达表明，肝移植后各细胞因子高表达，EN与对照组无差异。FK、FN组IL-2、IL-10、IFN-γ、大鼠肝移植后急性排斥反应时，外周血单个核细胞高表达Th1、Th2型细胞因子，可能产生Th1/Th2平衡漂移导致免疫排斥。应用FK506在抑制IL-2减轻排斥反应的同时，其他细胞因子也降低表达，维持Th1/Th2低水平上的平衡。在FK506造成的细胞因子低表达背景下，早期肠内营养可能通过保护肠道粘膜，减轻术后炎症反应，产生与FK506一致的协同效应。