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海藻糖是由两个葡萄糖分子通过半缩醛羟基缩合而成的非还原性双糖,广泛存在于自然界中。由于它具有对生物大分子和生物体组织非特异性的保护作用,从而在分子生物学、医学、食品工业、化妆品工业、农业等领域有着广阔的应用前景,但是海藻糖制取上的困难限制了它的广泛应用。本文立足于利用海藻糖合酶酶法合成海藻糖,研究内容包括产高温海藻糖合酶菌株的选育及其培养特性的研究、海藻糖定量分析方法的确定、菌体细胞酶释放体系、海藻糖合酶酶学特性及酶催化反应特性的研究。
通过高温诱导等手段从蒙古一处高温热泉水中筛选到一株产高温海藻糖合酶活性较高的菌株SN02004-01,并对其通过其形态特征、培养特征、生理生化特征和16S rRNA序列,根据《伯杰氏细菌鉴定手册》进行菌种分类鉴定。确定SN02004-01菌属于芽孢杆菌属,定名为Bacillus sp.SN02004-01(EF059895)。其最佳培养条件为:以麦芽糖1.0%为碳源,以蛋白胨0.5%、酵母膏0.25%、硝酸钠0.075%为复合氮源、硫酸镁0.025%、氯化钙0.01%、磷酸氢二钾0.05%,接种9h种龄的种子接种量为6%,培养基初始pH 7.0,65℃发酵培养24小时。
比较了多种对Bacillus sp.SN02004-01菌细胞酶释放处理的方法,确定细胞酶释放处理最佳体系为:试剂:2%甲苯+0.2%EDTA,菌体浓度为0.05g/ml,温度为35℃,转速为150r/min,最佳破壁时间为3h。对上述条件下处理好的酶液的性质进行系统研究的结果为:在底物麦芽糖浓度为10%、反应液pH为7.0、反应时间为20h条件下,酶的最适反应温度为60℃,在不高于70℃时稳定:酶的最适反应pH为pH7.0-7.5,pH稳定范围pH6.0-8.0。Fe<3+>、K<+>、Mg<2+>对酶的酶活有一定的激活作用,Na<+>对酶活的效果不明显,而Cu<2+>、zn<2+>对该酶有很强的抑制作用,研究发现该酶的底物特异性很强,只能特异性地将麦芽糖转化为海藻糖。通过对酶进行硫酸铵盐析、凝胶过滤层析、离子交换层析对酶液分离纯化,通过PAGE电泳确定分离纯化达到了电泳纯。通过SDS-PAGE电泳得到合酶的分子量为101.5KD。