草鱼呼肠孤病毒(grass carp reovirus,GCRV)是引发草鱼出血病的主要病原,严重影响我国草鱼养殖行业的发展。GCRV属于呼肠孤病毒科水生呼肠孤病毒属的双链RNA病毒,基因组分11个阶段,共编码12个蛋白。GCRV能引起宿主细胞基因转录水平和蛋白合成的变化,还会引起细胞融合、细胞凋亡等症状。细胞凋亡是受基因调控的一种细胞程序性死亡形式,许多病毒能够诱导细胞凋亡,细胞凋亡与病毒之间具有双向作用,宿主细胞能够通过细胞凋亡抑制病毒的感染,而病毒能够通过细胞凋亡释放病毒粒子。本文通过各种细胞凋亡检测技术对GCRV感染过程中CIK细胞的凋亡现象进行了研究,通过2-D电泳、RACE、RT-PCR等技术对草鱼Trap1基因进行了鉴定分析,并对其在GCRV诱导的CIK细胞凋亡中的作用进行了初步探讨。主要包括以下三个方面:(1)GCRV诱导CIK细胞凋亡的检测。本研究主要通过不同方法检测GCRV感染CIK细胞过程中的细胞凋亡现象。用MOI=10的GCRV病毒感染CIK细胞12h后,通过DAPI染色,检测到了明显的凋亡小体。用MOI=1的GCRV病毒感染CIK细胞0、3、6、12、24、36、48和60 h后,分别提取不同时间点的基因组DNA,然后通过凝胶电泳进行分析,结果显示,在感染24 h后能看到明显的DNA梯形条带。TUNEL检测试验也表明,用MOI=5的GCRV感染CIK细胞12 h和24 h后都能检测到明显的凋亡信号。同时,RT-PCR结果也表明,用MO1=1的GCRV感染CIK细胞不同时间点后,细胞内的Bax/Bcl-2和Caspase-3表达量分别在8 h和12 h开始上调。此外,用MOI=1的GCRV病毒感染CIK细胞12、24、36和48 h后,膜联蛋白标记之后通过细胞分析仪进行细胞凋亡的定量检测,结果显示,在病毒感染过程中细胞凋亡率逐渐上升并明显高于对照组。(2)草鱼Trap1基因的蛋白组学鉴定、克隆表达及分析。本研究通过对GCRV感染24 h后与未感染的CIK细胞全蛋白进行双向电泳和质谱鉴定对比分析,结果显示,蛋白点1061为草鱼Trap1蛋白,且病毒感染24 h后的草鱼Trap1蛋白表达水平是未感染的3倍以上。进一步通过RACE扩增技术,得到了2762 bp的草鱼Trap1基因全长,包含2157 bp的开放阅读框,编码718个氨基酸。同源性分析结果显示草鱼Trap1与斑马鱼Trap1同源性达到87%。将Trap1基因插入到p EGFP-N1载体质粒后进行亚细胞定位实验,结果显示草鱼Trap1蛋白主要在细胞质中表达,蛋白表达通过Western Blot实验进行验证。在Poly(I:C)刺激和GCRV感染不同时间点后,CIK细胞中的Trap1基因转录水平均出现上调。(3)草鱼Trap1基因调控病毒诱导的细胞凋亡。本研究为了探讨草鱼Trap1基因在GCRV诱导CIK细胞凋亡中的作用,先从草鱼CIK细胞c DNA中扩增出了与Trap1相互作用并参与细胞凋亡调控的两个因子PINK1和Sorcin的基因片段,并且在GCRV感染CIK细胞过程中,PINK1和Sorcin的转录水平表达均上调。针对Trap1基因,设计三条特异性的si RNA,并通过q RT-PCR筛选出沉默效果较好的Ci Trap1-si RNA2进行下游实验。GCRV感染si RNA处理后的CIK细胞,36 h后定量检测细胞凋亡率,结果显示,si RNA处理组细胞凋亡率明显高于未处理或阴性si RNA处理组。本研究通过不同方法检测GCRV感染CIK细胞的凋亡现象,结果表明GCRV能够诱导CIK细胞凋亡,然后通过双向电泳与质谱分析技术鉴定出了具有抗凋亡作用的蛋白Trap1,而后成功克隆得到了草鱼Trap1全长基因,并用si RNA基因沉默方法初步证明了Trap1在GCRV感染CIK过程中起到抗细胞凋亡的作用。