【摘 要】
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增强型绿色荧光蛋白(EGFP)能在多种原核和真核生物细胞中表达,其表达不受生物类型、基因型或细胞组织类型的限制,且EGFP具有易于检测、灵敏度高,荧光性质稳定,对细胞无毒害,
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增强型绿色荧光蛋白(EGFP)能在多种原核和真核生物细胞中表达,其表达不受生物类型、基因型或细胞组织类型的限制,且EGFP具有易于检测、灵敏度高,荧光性质稳定,对细胞无毒害,可直接用于活细胞测定等特性,被广泛应用于生命科学的各个领域。肉葡萄球菌(Staphylococcus carnosus)具有不产生任何毒素、溶血素、凝固酶、胞外蛋白水解活性低等特点,在基因工程中可以做为良好的宿主菌。蛋白质在细胞质合成并被转运至细胞壁外的过程中,需要信号肽的引导。目前在基因工程中,外源蛋白通常使用的分泌途径为Sec途径,但Sec转运系统只能转运未折叠或部分折叠的蛋白质,而Tat分泌系统能分泌正确折叠的蛋白质,因此Tat分泌途径能分泌一些无法用Sec途径分泌的蛋白质。穿梭载体具有二种不同的复制子,能在两种或多种宿主之间进行复制,穿梭载体在细菌中一般用于基因的扩增。本研究首先通过PCR方法获得20种N-末端带有连续5个相同氨基酸接头的EGFP融合基因(5x-egfp),导入大肠杆菌-葡萄球菌穿梭质粒pBT2-ET-EGFP中,构建成pBT2-ET-5X-EGFP重组质粒,再电转化入肉葡萄球菌TM300宿主中,研究肉葡萄球菌Tat途径对外源蛋白分泌表达的影响。本研究构建的 S.carnosus TM300/pBT2-ET-EGFP 与 S.carnosus TM300/pBT2-ET-5X-EGFP基因工程重组子经发酵培养,通过荧光显微镜检测到菌体能够发出绿色荧光,使用流式细胞仪检测到了荧光细胞,说明EGFP在重组子内已成功表达,使用蛋白电泳及Western blot分别检测重组子细胞壁和发酵液中的EGFP,结果 表 明 重 组 子 S.carnosus TM300/pBT2-ET-EGFP、S.carnosus TM300/pBT2-ET-5X-EGFP中表达的EGFP分泌到了细胞壁上,且以单体和二聚体二种形式存在,重组子S.carnosus TM300/pBT2-ET-5X-EGFP中的EGFP以二聚体的形式分泌到发酵液中。利用荧光分光光度计分别检测EGFP在重组子细胞壁和发酵液中的活性,结果显示分泌到细胞壁中的EGFP具有活性,分泌到发酵液中的EGFP未检测到活性。ELISA定量试剂盒检测到发酵液中EGFP的含量为100～150 ng/L。
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