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碘化N-正丁基氟哌啶醇(N-n-butyl haloperidol iodide,F2)是我课题组合成的一个新化合物。我们以往研究表明,F2有拮抗心肌缺血再灌注(ischemia/reperfusion,I/R)或心肌细胞缺氧复氧(hypoxia/reoxygenation,H/R)损伤的作用,其主要机制包括阻断细胞膜钙通道及抑制早期生长反应基因-1(early growth response gene-1,Egr-1)过表达。进一步研究发现,F2的保护作用与其提高心肌组织超氧化物歧化酶(superoxidedismutase,SOD)活性、降低丙二醛(malonaldehyde,MDA)含量有关,间接表明F2对ROS起着负性调节作用。此外,我们研究还发现,给予Egr-1反义寡核苷酸也有类似F2的作用,表明Egr-1表达与ROS之间存在一定的关系。大量研究表明,活性氧(reactive oxygen species,ROS)所致的氧化应激在I/R损伤过程中起着重要作用。而近年来,转录因子Egr-1又被认为是I/R损伤的共同分子基础。据文献报道,ROS可以激活丝裂原活化蛋白激酶家族(mitogen-activated protein kinases,MAPKs)尤其是c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase,JNK)。而又有研究表明MAPK信号通路中的JNK及ERK1/2可能参与了I/R激活的Egr-1表达。因此,本研究以JNK及ERK1/2为切入点,借助于H9c2心肌细胞系H/R模型,探讨H/R时,H9c2心肌细胞内是否存在ROS/JNK(ERK1/2)/Egr-1信号通路以及F2是否可以通过调节此通路起到保护H/R心肌的作用,这将进一步补充和完善F2的作用机制,提高其研发价值。 I/R损伤是常见的病理生理过程,目前I/R损伤的发病机制尚未完全明了。国内外进行I/R的相关研究时,主要集中在受累最严重的脏器特有或主要的组成成分,制作H/R模型时也普遍采用其主要的或特有的细胞。而I/R时,炎症细胞是造成I/R损伤进展的主要参与者,但鲜有建立炎症细胞H/R模型并进行相关研究的报道。因此,本研究以巨噬细胞RAW264.7为对象,建立了炎症细胞H/R模型,并对其生物学意义作初步探讨。 方法: 第一部分:H9c2心肌细胞 1.将培养的H9c2心肌细胞随机分为10组:对照(control)组、control+ROS激活剂XO/HX(con+XO/HX)组、control+JNK激动剂ANISO(con+ANISO)组、缺氧复氧(H/R)组、H/R+ROS清除剂依达拉奉(H/R+EDA)组、H/R+ROS清除剂N-乙酰基-L-半胱氨酸(H/R+NAC)组、H/R+JNK抑制剂SP600125(H/R+SP600125)组、H/R+F2组、H/R+F2+XO/HX(H/R+F2+XO/HX)组、H/R+F2+ANISO(H/R+F2+ANISO)组。control组于实验前换用新鲜培养基持续培养细胞3h;con+XO/HX组和con+ANISO组分别于培养基中加入XO/HX、ANISO常氧培养1h,再换用新鲜培养基培养3h;H/R组细胞换用被高纯氮气饱和30min的缺氧液,置缺氧盒中37℃密闭培养2h,然后换用正常培养基于常规条件下培养细胞1h,建立H/R损伤模型;H/R+EDA组、H/R+NAC组和H/R+F2组于缺氧前30min、缺氧液及复氧培养基中分别给予EDA(2×10-4M)、NAC(8×10-3M)和F2(1×10-6M);H/R+SP600125组于缺氧前30min和缺氧液中给予SP600125(2×10-5M);H/R+F2+XO/HX组和H/R+F2+ANISO组于缺氧前先给予F2(1×10-6M)30min,接着分别给予XO(1×10-5M)/HX(5×10-4M)、ANISO(10ng/ml)1h,然后在缺氧液和复氧液中给予F2。 2.用流式细胞仪法检测H9c2心肌细胞内ROS水平:明确H/R时,心肌细胞内ROS的生成情况及F2对其调节作用。 3.用Western-blot方法检测H9c2心肌细胞Egr-1、磷酸化JNK(p-JNK)、总JNK、p-ERK1/2、总ERK1/2蛋白表达的变化:分别借助ROS及JNK的激动剂和抑制剂,明确ROS/JNK(ERK1/2)/Egr-1信号通路是否参与心肌细胞H/R损伤及F2于其中的作用。 4.用Real-TimePCR方法检测H9c2心肌细胞Egr-1mRNA水平。 第二部分:RAW264.7巨噬细胞 1.将培养的RAW264.7巨噬细胞随机分为3组:control组、H/R组、H/R+EDA组。control组于实验前换用新鲜培养基持续培养细胞150min;H/R组细胞换用被高纯氮气饱和30min的缺氧液,置缺氧盒中37℃密闭培养2h,然后换用正常培养基于常规条件下培养细胞30min,建立H/R损伤模型;H/R+EDA组于缺氧前30min、缺氧液及复氧培养基中均给予EDA(1×10-6、1×10-5、1×10-4M)。 2.倒置荧光显微镜下定性观察RAW264.7巨噬细胞ROS的生成情况。 3.流式细胞仪定量检测RAW264.7巨噬细胞内ROS水平。 结果: 第一部分:H9c2心肌细胞 1.H/R促使H9c2心肌细胞内ROS生成增多,ERK1/2、JNK激活,Egr-1mRNA和蛋白高表达;F2能使H/R所致的ROS含量降低,下调H/R所致p-JNK、Egr-1mRNA及蛋白的高表达,且呈一定的剂量依赖性;各组间总ERK1/2及总JNK的表达变化差异无统计学意义(P>0.05)。 2.ROS清除剂EDA、NAC可降低H9c2心肌细胞H/R时ROS含量,下调H/R所致JNK活化、Egr-1mRNA和蛋白的高表达;ROS清除剂EDA、NAC对H/R所致H9c2心肌细胞内ERK1/2活化无明显影响;ROS激活剂XO/HX可拮抗F2对H/R心肌细胞ROS大量生成、p-JNK表达增加、Egr-1mRNA和蛋白高表达的抑制作用。 3.JNK抑制剂SP600125可抑制H/R时Egr-1mRNA和蛋白的高表达;JNK激动剂ANISO可拮抗F2对H/R心肌细胞所致JNK活化、Egr-1蛋白及Egr-1mRNA高表达的抑制作用。 第二部分:RAW264.7巨噬细胞 1.倒置荧光显微镜下显示,H/R使RAW264.7巨噬细胞内ROS荧光增强,ROS生成增多。 2.流式细胞仪检测到H/R使ROS生成增多,且随H/R时间的延长,ROS水平逐渐升高。ROS清除剂EDA可剂量依赖地抑制巨噬细胞H/R所致ROS的大量生成。 结论: 1.H/R可导致H9c2心肌细胞ROS/Egr-1信号通路激活,JNK的活化于此通路中起了重要的介导作用。 2.F2对H/R所致的ROS/JNK/Egr-1信号通路具有调节作用,这可能是其拮抗心肌I/R损伤的一个重要机制。 3.应用制备缺氧液与氮气饱和相结合的方法可建立简单可行的巨噬细胞H/R模型。