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松材线虫病（Pine wilt disease）是松树的一种毁灭性病害,在世界上多个国家和地区都被列为最危险的森林灾害之一,其病原松材线虫（Bursaphelenchus xylophilus）也被列为我国一级林业有害生物。近年来,疫情向北扩散蔓延势头迅猛,危害形势更加严峻,严重威胁我国林业发展和生态安全。之所以呈现如此严峻的形势,除了广泛存在的寄主、媒介昆虫以及现有的防控措施不能满足需求外,松材线虫自身的快速繁殖和适应机制是其内在的关键因素。因此,从繁殖生物学角度对松材线虫进行研究有助于为阐释松材线虫的入侵和扩散机制奠定基础,并有利于从交配、繁殖等方面找到有效防治松材线虫病的思路和措施。择偶是两性交配中的重要环节,交配则是两性生物种群繁殖的前提,快速繁殖是种群扩张的基础。本研究从松材线虫交配过程中的择偶出发,针对雌雄虫在择偶前期雌雄虫相互吸引靠近和接触后雌性对雄性的选择两个现象展开研究,并从分子生物学角度对松材线虫的两性吸引和雌虫择偶偏向的内在机制进行探讨。主要结果如下:1)通过琼脂板两点趋性测试法明确了松材线虫雌雄虫之间相互吸引,雌虫对雄虫的吸引性显著大于雄虫对雌虫的吸引性,且同性之间不产生吸引性。雌雄虫分泌物能对异性产生同等效力的吸引作用,表明分泌物可能是两性吸引的来源。2)UPLC-Q-TOF/MS分析推测松材线虫雌雄虫分泌物之间的差异物质以中长链蛔甙为主。雄虫交配前后差异显著的物质有5种,分别是未交配雄虫中的ascr#12、bhas#18、ascr#32,ibha#24和已交配雄虫中的ascr#18;雌虫交配前后的差异物质有3种,分别是未交配雌虫中的ascr#18,已交配雌虫中的ascr#12和ibha#18。雌雄虫之间差异显著的物质有9种,包括ascr#15、bhas#16、bhas#20、ascr#23、icas#12、bhas#34、ibha#20、icas#21和icas#22。这些差异性蛔甙可能在松材线虫的两性吸引中起作用。3)对松材线虫蛔甙生物合成过氧化物β氧化途径下游基因Bx-daf-22进行RNAi沉默后的功能分析表明Bx-daf-22.1,Bx-daf-22.2和Bx-daf-22.3共同干扰以及Bx-daf-22.3单独干扰能引起雌性对雄性的吸引力显著增强,由于daf-22干扰能引起分泌物中短链蛔甙的大量减少,同时造成上游中长链蛔甙的增加,这间接证明了中长链蛔甙可能是引起松材线虫雌性对雄性产生吸引性的主要物质。4)为了进一步验证中长链蛔甙在松材线虫两性吸引中的作用,又对松材线虫过氧化物β氧化途径上游控制中长链蛔甙生物合成的Bx-acox基因进行了RNAi,基因沉默后的表达量检测和趋性测试表明Bx-acox1.1和Bx-acox1.2共同干扰能引起雌性对雄性的吸引力显著下降,补充说明了中长链蛔甙在松材线虫雌性对雄性吸引中的作用。5)松材线虫雌雄虫交配过程的显微观察显示雌雄虫相互吸引彼此靠近后,雌虫会通过对雄虫的数次接触进行识别判断来选择最终的交配对象。在同时面对未交配和已交配雄虫的情况下,雌虫往往会选择未交配雄虫进行交配。通过对未交配和已交配雄虫活跃度、对雌虫分泌物的响应度、对雌性的吸引力和对已交配雄虫进行营养恢复后再选择等方面的差异比较分析来探究雌性产生择偶偏向的原因,结果表明已交配雄虫的营养恢复能明显消除雌性的择偶偏向。6)对松材线虫交配前后的雌雄虫以及营养恢复已交配雄虫进行转录组分析以揭示雌虫产生择偶偏向的原因。雄虫的转录组分析表明,未交配和营养恢复雄虫相对于已交配雄虫上调的差异基因种类相同,主要是与线虫身体结构发育相关的胶原蛋白基因,大分子代谢酶以及谷胱甘肽转移酶、组织蛋白酶等与降解外来物质有关的肽酶类;在未交配雄虫中相对已交配雄虫显著下调的基因主要是转运蛋白,脱氢酶和水解酶等参与刺激响应和渗透调节信号途径的酶;在营养恢复雄虫中相对已交配雄虫显著下调的是蛋白二聚体活性相关酶。营养恢复雄虫相比未交配雄虫显著上下调的基因都较少,上调的主要是谷胱甘肽转移酶,纤维素酶和转运蛋白等,可能受雄虫在营养恢复过程中的取食活动以及对外界环境适应性的影响;下调的主要是个别胶原蛋白家族基因和一些组织蛋白酶,可能与已交配雄虫在营养恢复过程中身体胶原蛋白骨架结构恢复的完善度有关。这些结果表明与雄虫身体结构恢复相关的胶原蛋白基因和能量代谢酶可能与雌虫的择偶偏向有较大相关性。7)对交配前后雌虫的转录组分析表明雌虫交配后上调的主要是组织蛋白酶和水解酶类,下调的主要是少量胶原蛋白基因和肽酶类。雌雄虫的比较分析表明,雌虫交配后下调的基因70%以上在雄虫交配后同样呈现下调表达,说明雌雄虫在交配过程中经历了近乎相同的代谢进程。但雄虫交配后下调的基因远多于雌虫,且以胶原蛋白基因和大分子代谢酶为主,而这些基因在已交配雄虫进行营养补充后大多都恢复表达量。说明雄虫在交配过程中的能量和身体结构变化远大于雌虫,同时再次表明这些变化可能是造成雌虫对雄虫产生择偶偏向的主要原因。综上所述,松材线虫雌雄虫在交配过程中先通过分泌物相互吸引靠近潜在配偶,再经过雌雄虫多次接触选择进行交配。雌雄虫分泌物中差异性的中长链蛔甙可能在雌虫对雄虫的吸引中起作用;雌虫择偶偏向的转录组分析初步表明雄虫交配后胶原蛋白基因表达量显著下降,并且在对已交配雄虫进行营养恢复后这些基因几乎都恢复正常表达,而这些胶原蛋白基因在雌虫交配前后表达量大多没有明显变化,说明这些胶原蛋白基因在雄虫交配中可能起特殊作用。前人研究表明这些胶原蛋白基因与线虫雄性尾部交合伞和射线感知体系的发育有关,而交合伞和感知体系在雄虫的定位和交尾中起重要作用,因此推测已交配雄虫尾部交合伞和射线感知结构发育缺陷可能是造成雌性产生择偶偏向的主要原因。该研究阐释了松材线虫交配过程中的两性吸引和择偶特征,将为进一步研究松材线虫的繁殖生物学机制和从繁殖生物学角度采取措施防治松材线虫提供理论基础。