目的：　　 缺血性脑血管病是威胁人类健康的三大疾病之一,具有发病率、死亡率、致残率及复发率高的特点,给家庭和社会带来沉重的精神和经济负担。超早期溶栓治疗虽然证实有效,却受到治疗时间窗(3-6小时)和易诱发脑出血等副作用的限制,目前急需寻找新的治疗途径。干细胞移植作为一种不同于传统治疗的全新方法可以重塑受损的神经元通路和改善神经功能缺失,已成为缺血性脑血管病治疗方面的研究热点。近年来,用于治疗缺血性脑血管病的干细胞包括神经干细胞(neuralstem cell,NSC)和骨髓间充质干细胞(bone marrow-derived mesenchymal stem cells,MSCs)。神经干细胞来源于人的脑组织或人胚胎干细胞,受到医学伦理限制,不适合自体移植。骨髓间充质干细胞,是来源于骨髓的一种具有自我复制和多向分化潜能的非造血干细胞,不仅可以分化为骨、软骨、脂肪等间质细胞,在适宜的条件下,还能分化为神经细胞。与NSC相比,MSCs具有以下特点:(1)容易获取,来源丰富,不存在伦理学争议;(2)可自体移植,避免了免疫排斥反应;(3)体外容易扩增,能稳定、高效的表达外源基因。所以MSCs更适合用于缺血性脑血管病的干细胞移植治疗。而MSCs移植入体内后的低成活率限制了其应用。Chen等研究发现,MSCs的神经细胞转化率在体外可高达80％,而在体内仅约为3～10％,其原因虽然复杂,但主要是MSCs移植至体内后,其自身发生凋亡所致。因此,如何减少其移植后凋亡的发生,提高MSCs在体内的存活率及向神经细胞定向分化的能力是目前干细胞移植治疗脑缺血亟待解决的主要问题。Bcl-2基因(Bcell lymphoma/leukemia gene2,Bcl-2 gene)是目前研究较为明确的抗凋亡基因。如果将Bcl-2基因转染到MSCs,可能会减少移植后的MSCs的凋亡,提高MSCs的存活率,从而解决这一难题。最近国外学者Li等将Bcl-2基因修饰的MSCs移植入心肌梗死大鼠模型,发现Bcl-2能够增加移植后的MSCs的存活率,并且不影响MSCs的多向分化潜能,心肌梗死灶周围的毛细血管密度增加15％,心肌梗死病灶缩小17％,心肌功能得到明显改善。目前国内外尚无移植Bcl-2基因修饰的MSCs治疗脑缺血的相关报道,故本课题组拟将Bcl-2基因在体外转染至MSCs,进一步拟研究Bcl-2基因转染的MSCs是否能够提高MSCS的抗凋亡能力,及在体外是否具有向神经细胞分化的潜能。总之,为寻找简便、快捷、安全、有效的治疗脑缺血的方法,本课题组拟采用慢病毒载体,在体外将抗凋亡基因Bcl-2转染至MSCs,探索提高外源性MSCs移植到体内的存活率的新方法。从而为今后临床应用MSCs治疗缺血性脑血管病打下坚实的理论和实验基础,为治疗该病开辟一条新的有效途径。　　 方法：　　 根据小鼠Bcl-2基因序列设计引物,在5’端分别加上attB1和attB2位点,以小鼠cDNA为模板,上述设计引物进行PCR扩增。PCR产物通过电泳检测后进行回收,纯化,BP结合反应.构建pDOWN-mBcl-2载体,pDOWN-mBel-2载体的转化和检测,LR结合反应.构建pLV/EXPN2-Puro-EF1A-mBcl-2表达载体,及其转化和检测,慢病毒包装。测定Neomycin和Puromycin对F344大鼠MSCs的最适筛选浓度,携带eGFP慢病毒转导F344大鼠MSCs,Neo筛选成功转导的MSCs,携带mBc-12慢病毒转导MSCs-eGFP,puro筛选成功转导的MSCs,扩增转导后的MSCs,RT-PCR法检测转染后Bcl-2的表达,采用血清剥夺和缺氧(SOD)处理建立MSCs体外模拟缺血性损伤模型,通过流式细胞术评价转导Bcl-2基因的MSCs(Bcl-2-MSCs)和未转染的MSCs的凋亡及存活情况。对Bcl-2-MSCs行神经诱导及检测。大鼠新生鼠海马神经元细胞原代分离及培养,Bcl-2-MSCs与海马神经元共培养,观察Bcl-2-MSCs对海马神经元缺氧的保护作用。　　 结果：　　 以小鼠Bcl-2基因cDNA为模板,经测序证实构建慢病毒载体成功,puro筛选出成功转导Bcl-2基因的MSCs,Bcl-2-MSCs可稳定、高效的表达Bcl-2蛋白;流式细胞术检测显示和MSCs相比,转染Bcl-2基因的MSCs在SOD后凋亡细胞较少,存活细胞较多,细胞凋亡率下降,两者比较具有统计学差异(P＜0.01)。转导Bcl-2基因的MSCs仍具有向神经细胞分化的潜能,未发现Bel.2-MSCs异常增生。Bcl-2-MSCs、MSCs与海马神经元共培养,能有效的保护海马神经元,抑制其凋亡,降低凋亡率,与对照组(单纯培养的海马神经元)比,凋亡率下降具有统计学差异(P＜0.01)。Bcl-2-MSCs组较MSCs组凋亡率下降明显,两者比较具有统计学差异(P＜0.01)。　　 结论：　　 1、慢病毒载体法可稳定高效的转导Bcl-2基因到MSCs,获得Bcl-2-MSCs稳定表达载体。　　 2、Bcl-2-MSCs能高效表达Bcl-2基因,提高Bcl-2-MSCs自身抗凋亡能力。　　 3、Bcl-2-MSCs仍具有向神经细胞分化的潜能,说明Bcl-2转导不影响MSCs多向分化潜能。　　 4、体外培养Bcl-2-MSCs,未发现其异常增生,提示慢病毒转导Bcl-2至MSCs安全性高,尚需进一步体外及体内实验观察Bcl-2-MSCs及对其他组织细胞的影响。　　 5、Bcl-2基因转导MSCs可作为治疗脑缺血的潜在治疗手段。