肉毒毒素（Botulinum toxins,BoNT）是由厌氧的肉毒梭状芽孢杆菌（Clostridium botulinum）产生的一种毒性极强的蛋白类神经毒素,是目前自然界中已知生物和化学毒素中毒性最强的物质。BoNT共有7种血清型（A～G）,自然情况下A、B、E、F型均可导致人类肉毒中毒。其中,A型肉毒毒素（BoNT/A）毒性强且报道病例多,有关A型毒素单克隆抗体（mAb）的研究也比较多。而对B型肉毒毒素（BoNT/B）单克隆抗体的研究则不及A型毒素广泛深入。迄今为止尚无有效的BoNT/B中和抗体用于临床,因此筛选抗BoNT/B的单克隆抗体具有重要意义。本研究旨在通过B细胞杂交瘤和噬菌体抗体库技术筛选抗B型肉毒毒素特异性强、亲和力高的单克隆抗体。以B型肉毒毒素Hc片段（BoNT/BHc）为抗原免疫BALB/c小鼠,取尾血上清分析效价,选取效价最高的小鼠脾细胞与Sp2/O骨髓瘤细胞融合,平均融合率达到95%,平均阳性率为84%。经有限稀释法进行3次克隆化培养,得到9株能够稳定表达抗体的杂交瘤细胞株,选取其中命名为1E9-H2的阳性细胞株制备腹水抗体。经Protein G亲和层析纯化,获得纯度大于96%的抗体,分子量大小与抗体重链轻链大小相符,以线性表位与抗原BoNT/BHc特异性结合。经亚型鉴定抗体重链为IgG1型,轻链为κ型,均为鼠源单抗中较为常见的亚型。1E9-H2抗体与BoNT/BHc抗原的亲和力常数为6.7×10-9mol/L,达到了n M级别,是一株具有高亲和力的鼠源单克隆抗体。采用BoNT/AHc、BoNT/BHc、BoNT/EHc和BoNT/FHc 4种抗原对小鼠进行联合免疫,以获得对A、B、E、F型肉毒毒素具有中和活性的广谱抗体。小鼠经联合免疫,对4种抗原的效价均达到1:32000。取效价最高小鼠脾细胞与Sp2/O骨髓瘤细胞进行融合,融合率为100%,其中能够产生抗A、B、E、F型肉毒毒素广谱单克隆抗体的细胞阳性率为21.09%,从中挑选14株阳性细胞采用有限稀释法进行3次克隆化培养后,选取2B11、3H3、1C5和3C3这4株阳性细胞制备腹水抗体,经Protein G柱纯化后,抗体纯度均大于90%,分子量大小与抗体重链轻链大小相符。经非竞争ELISA测定,两个抗体均能与4种抗原交叉反应,具有广谱性。抗体2B11与BoNT/A/B/E/FHc 4种抗原的亲和力常数依次为2.8×10-8、2.8×10-8、2.2×10-8、2.6×10-8mol/L;抗体3H3与BoNT/A/B/E/FHc 4种抗原的亲和力常数分别为2.5×10-8、1.2×10-9、3.8×10-8、3.4×10-8mol/L;抗体1C5与BoNT/A/B/E/FHc 4种抗原的亲和力常数分别为3.7×10-8、8.8×10-9、5.0×10-8、5.9×10-8mol/L;抗体3C3与BoNT/A/B/E/FHc 4种抗原的亲和力常数分别为6.7×10-8、1.4×10-9、6.9×10-8、8.8×10-8mol/L,其中抗体3H3、1C5和3C3对4种抗原中的BoNT/BHc亲和力最高,达到了n M水平。亚型鉴定2B11、1C5和3C3抗体重链为IgG1型,3H3抗体重链为IgM型,轻链均为κ型。经鉴定2B11、3H3、1C5和3C3抗体均为高亲和力鼠源广谱单克隆抗体。应用噬菌体展示技术构建包含全套抗体可变区基因信息的鼠源噬菌体单链抗体库。以BoNT/BHc为抗原免疫BALB/c小鼠,选取血清效价为1:64000的小鼠脾细胞为基因来源,将提取的总RNA逆转录成cDNA后PCR扩增抗体轻重链可变区基因,随机组装成单链抗体片段ScFv,采用分子克隆的方法将其连入噬菌粒载体pCANTAB-5E,经PCR鉴定ScFv插入率为90%,成功构建了库容量为5.0×10~6的噬菌体单链抗体库。以BoNT/BHc蛋白为抗原采用固相筛选的方法对噬菌体抗体库进行四轮吸附—洗脱—富集,成功筛选到2株鼠源单链抗体ScFv-A9和ScFv-A1。将鼠源抗体进行人源化改造,构建嵌合抗体表达载体,利用哺乳动物表达系统Free Style TM293-F成功表达了人源嵌合抗体ScFv-A9,经纯化获得了99%高纯度的人源抗体蛋白。综上所述,经过筛选共获得6株抗B型肉毒毒素的单克隆抗体,包括5株鼠源抗体和1株人源抗体。其中2B11、3H3、1C5和3C3抗体是能够与A、B、E、F型肉毒毒素Hc段交叉反应的广谱单克隆抗体。本研究获得的单克隆抗体为肉毒毒素抗体药物研发和检测奠定了基础,本文构建的抗体库亦可用于B型肉毒毒素单链单抗的大量筛选。