小鼠雌性生殖干细胞的分离及其生物学特征研究

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哺乳动物雌性生殖研究领域传统观念认为,哺乳动物如小鼠和人类在出生时或者出生数天内卵巢中卵细胞的数目便确定了,卵巢中卵细胞无更新能力,不断出现的卵泡发生过程最终导致卵细胞的耗尽。本研究通过多次贴壁法从出生后雌性卵巢中分离出雌性生殖干细胞,在体外培养中成功发现生殖细胞旺盛分裂现象。证明了在ICR小鼠品系中,出生后小鼠卵巢中仍然存在着能旺盛分裂的雌性生殖干细胞。通过对培养体系中有丝分裂的统计分析,发现不同鼠龄卵巢具有的雌性生殖干细胞数目并不一致,而是随着小鼠卵巢发育逐步减少。在出生后1-3天的新生小鼠卵巢中,能进行有丝分离的雌性生殖细胞数目最多。通过观察雌性生殖细胞分裂现象,发现进行有丝分裂的雌性生殖干细胞直径大小为15-25 μm,在增殖过程中出现细胞连接现象,即分裂后的细胞核分离而细胞质仍然连接。这一现象与PGC向卵原细胞分化时形成的生殖细胞囊类似。在雌性生殖干细胞培养过程中,发现GDNF的去除有助于雌性生殖细胞的生长,当雌二醇(E2)和GDNF同时存在时,生殖细胞生长进一步受到抑制。为了研究GDNF与E2对雌性生殖细胞分化的协同促进作用,对Gfra1启动子进行了分析。通过荧光素酶报告系统,证明E2与雌激素受体蛋白ESR1正调控Gfra1基因的表达。通过相关实验认为,E2激活生殖干细胞中Gfra1基因的表达,通过GDNF-GFRA1-RET通路促进雌性生殖细胞的分化。磁珠分离法得到VASA+雌性生殖干细胞在细胞形态和表达谱与贴壁法分离的雌性生殖干细胞存在着差异。磁珠分选雌性生殖干细表达Sox2和Nanog,在培养过程中容易出现向多能性细胞转化现象。根据相关实验数据,认为磁珠分选的雌性生殖干细胞更接近原始生殖细胞状态,而贴壁法得到的雌性生殖干细胞更接近卵原细胞。本研究提出了新的雌性生殖干细胞分离方法,并对新方法得到的雌性生殖干细胞与磁珠分离法得到的雌性生殖干细胞生物学特征进行了比较。本研究丰富了对小鼠雌性生殖干细胞来源、增殖和分化的认识。
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