纵观灵芝发酵生产的整个进程及其研究现状,灵芝酸等活性物质产量低是发酵法不能进行商业化生产的主要原因。研究表明,通过构建高表达工程菌株可以显著提高灵芝酸的生物合成量,因此,转基因技术是灵芝酸等活性物质增产的有效策略。目前的研究多集中于通过过表达灵芝酸或灵芝多糖生物合成途径中的关键酶基因,从而实现增产目的。LaeA是丝状真菌全局性调控因子之一,参与其形态发育和次级代谢的调控。研究发现,LaeA基因对丝状真菌次级代谢相关基因簇的表达水平及次级代谢产物的产量具有正调控效应。灵芝作为高等丝状真菌之一,其形态发育和次级代谢是否受LaeA基因的调控、如何调控及内在的调控机制方面至今未见报道。本研究采用转基因技术构建灵芝LaeA基因沉默菌株、过表达LaeA基因cDNA序列菌株及过表达LaeA基因全序列菌株,对其菌丝生长、产孢能力、糖消耗能力、灵芝酸和灵芝多糖产量以及合成相关基因表达情况进行检测,探究LaeA基因对灵芝形态发育和次级代谢的调控作用及其内在的调控机制。通过研究LaeA基因沉默、过表达LaeA基因cDNA序列、过表达LaeA基因全序列对灵芝形态发育和次级代谢的影响,结果表明:(1)LaeA基因沉默菌株菌丝生长缓慢甚至停滞生长,菌丝形态改变,分叉增多、菌丝量减少,产孢能力下降;生物量下降,糖消耗减少;总灵芝酸、羊毛甾醇及灵芝多糖的合成减少;灵芝酸合成相关基因(hmgr,sqs,ls)及灵芝多糖合成相关基因(ugp,pgm,gls)的表达水平处于动态平衡。(2)过表达LaeA基因cDNA序列菌株菌丝生长显著加快,在培养第3天时菌丝半径是WT菌株的4.5倍,菌丝厚密、坚韧,形态改变,分叉增多,但丧失产孢能力;细胞生物量显著下降,但糖消耗能力显著上调;不产灵芝酸,灵芝多糖合成下调;灵芝酸合成相关基因(hmgr,sqs,ls)及灵芝多糖合成相关基因(ugp,pgm,gls)表达量均显著下调,甚至不表达。(3)LaeA基因过表达菌株表现出菌丝生长显著加快,在培养第3天时菌丝半径是WT菌株4.0倍,产孢能力明显增强,但菌丝结构无变化;生物量显著增加,糖消耗加快;灵芝酸、羊毛甾醇、胞内多糖及胞外多糖合成均上调,最大合成量分别是WT菌株的3.62、3.58、1.42及1.78倍;灵芝酸合成相关基因hmgr,sqs,ls表达均上调,且最大表达量分别是WT菌株的23.74、2.12、8.62倍;灵芝多糖合成相关基因ugp在培养第3天时表达上调,且是WT菌株的1.65倍,但在后续培养过程中,ugp基因表达显著下调,呈沉默状态;而pgm,gls表达均上调,且最大表达量分别是WT菌株10.73、3.38倍。综上所述,本研究首次探索了LaeA基因对灵芝形态发育和次级代谢的调控作用。本研究发现,LaeA基因参与灵芝形态发育和次级代谢的调控,且对灵芝酸和灵芝多糖合成相关基因簇的表达水平及产量具有正调控效应。表明通过转基因技术构建灵芝LaeA基因高表达工程菌株是灵芝酸增产的策略之一。同时,本研究为进一步阐明LaeA基因对丝状真菌代谢的调控机制提供理论支持。