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纤维素酶、半纤维素酶和木质素酶是木质纤维素资源高效转化利用的关键酶,其活力和成本是生物炼制技术发展的主要瓶颈。同时木质纤维素转化为高附加值产品还存在非粮木质纤维素原料的选育困难、预处理复杂等技术瓶颈。目前能源危机、环境污染和粮食紧张三方面问题给社会的可持续发展带来了许多的困难,人们的目光聚焦到了生产经济有效而又环境友好的生物燃料和其他高附加值产品上,其中高效降解木质纤维素的微生物及其酶系正成为研究关注的焦点。为了寻找新型生物质能源植物和高效降解纤维素的细菌,本文利用课题组前期从垃圾填埋场和泥炭中筛选得到的纤维素降解菌株,水解纤维素植物美洲龙舌兰。通过龙舌兰-琼脂平板法定性分析18株细菌的纤维素内切酶活力,筛选出了降解龙舌兰的优势菌种：55S2(杜擀氏菌),65S3(芽孢杆菌)和CDS3(假单胞杆菌)。使用乙醇分析测定试剂盒和高效液相法(HPLC)测定其转化产物,发现芽孢杆菌65S3和假单胞杆菌CDS3降解龙舌兰生产生物乙醇和木糖醇的性能优越于其他16株细菌。芽孢杆菌属菌株(65S3)降解龙舌兰生产生物乙醇最高产率为0.92g/g。而假单胞菌属菌株(CDS3)降解龙舌兰生产生物木糖醇最高产率为0.98g/g。利用扫描电子显微镜观察3株细菌降解龙舌兰的形态学都有不同程度的改变。因此龙舌兰是一种生产生物乙醇和木糖醇的理想原料,芽孢杆菌65S3和假单胞杆菌CDS3能够生产高附加值产品,在生物炼制行业具有巨大潜力。自然界中参与降解木质纤维素材料的微生物除细菌外,真菌也具有很强的木质纤维素分解能力,尤其是木霉属中的里氏木霉(Trichoderma reesei)产生的纤维素酶各组分最为齐全。为提高里氏木霉降解木质纤维素的能力,提高木质纤维素酶的表达量,课题组前期以QM9414为宿主菌,成功导入转录调控因子基因Ace2,得到工程菌T/Ace2-2, T/Ace2-5, T/Ace2-8, T/Ace5-4和T/AcelO-1。本文对这5个工程菌的酶活进行了全面研究,结果显示T/Ace2-2总滤纸酶酶活的最大值比宿主菌QM9414最大酶活力增加了2倍,并且第6天木聚糖酶酶活为其宿主菌的1.12倍。利用HPLC法研究工程菌T/Ace2-2降解树皮生成木糖醇的产率,将T/Ace2-2接种于木糖-MA培养基第6天时树皮被转化为木糖醇的产率最大为0.12g/g。使用扫描电子显微镜观察可见工程菌T/Ace2-2降解树皮的形态也发生了显著变化。因此,里氏木霉工程菌T/Ace2-2能高效降解未经预处理的树皮等木质纤维素,为实现了木糖醇产业的清洁化生产和生产成本的下降提供了有用的实验数据。为赋予里氏木霉降解木质素的能力,课题组前期以QM9414为宿主菌,成功异源表达了木质素过氧化物酶基因lipH8,得到了工程菌T/Lip4-3, T/Lip8-5和T/Lip10-7。本文通过对工程菌T/LiP4-3, T/LiP8-5和T/LiP10-7的木质素过氧化物酶酶活的研究,证实了工程菌T/LiP10-7第15天过氧化物酶酶活力达最高值64.47IU/ml,进而用液相色谱-质普联用仪(LC-MS)对工程菌T/LiP10-7降解木屑的产物进行分析,发现其产物有乙酰丙酸和苯等,扫描电镜实验也说明经过工程菌T/LiP10-7降解后木屑内部结构发生了明显变化。故里氏木霉工程菌T/LiP10-7可用于降解木屑等木质纤维素,生产高附加值产品。为研究里氏木霉纤维素酶和木聚糖酶的结构、功能以及遗传改造方向,我们对里氏木霉的内切葡聚糖酶EGIV和木聚糖酶xyn1、xyn2氨基酸序列进行了特征分析,使用Discovery studio对EGIV进行了同源模建,并通过Line Plot图和Profiles-3D方法对预测的结构进行了评估,结果表明预测结果合理。通过Molegro Virtual Docker (MVD)软件对EGIV和xyn1、xyn2进行对接实验,并对得到的配体与酶的结合位点进行了保守性分析,结果表明xynl与木二糖配体存在6个高度保守位点：Glu75、Asp 33、Met 79、Phe121、Glu164和Trp166。Xyn2也存在类似的结果,但整体保守性程度要高于xynl,高度保守位,点分别是：Phe45、Val46、Trp 79、Arg 122、Asn44、Glu 86、Tyr88和Glu 177。对里氏木霉纤维素酶EGⅣ进行分子对接,我们共获得22个与纤维二糖配体结合的位点,其中有17个位点是高度保守位点：His 1、Gly2、His 3、Pro 20、 Trp34、Ala36、Gly42、Val44、Ser45、Ala48、His57、Lys58、Asn169、Ala171、 Tyr 174、Pro 175和Cys 177。基于以上关键氨基酸位点,理性设计改造里氏木霉的纤维素酶和半纤维素酶,期望能获得有工业应用价值的酶制剂。基于此,芽孢杆菌属菌株(65S3)、假单胞菌属菌株(CDS3)和里氏木霉工程菌T/Ace2-2和T/LiP10-7可水解和发酵未经预处理的木质纤维素资源,生成环境友好型的生物乙醇、木糖醇等高附加值产品。