目的:结直肠癌是位于全球肿瘤发病率第三位的恶性肿瘤,也是导致肿瘤患者死亡的第四大癌种。结直肠癌发病率在逐年升高,预计到2035年该病的发病率是现在的一倍。目前,外科手术仍然是治疗结直肠癌的主要手段,化疗是辅助手段。随着药物研究的进展,靶向治疗药物如抗血管内皮生长因子抗体以及表皮生长因子抗体已经被美国食品及药品管理局（FDA）批准用于治疗转移性结直肠癌,但靶向治疗往往存在局限性,比如有的药物需要在治疗前进行基因检测,以及普遍有费用高、疗程长的缺点。PD-1单抗和CTL-A4抑制剂的联合治疗,也显示出疗效,但只在基因微卫星不稳定的患者中效果明显。纳曲酮（naltrexone,NTX）又称为盐酸纳曲酮,最早由美国杜邦公司1963年研发,并于1984年通过FDA的审查、上市,主要用于阿片药物成瘾、酒精依赖和毒品戒断等方面的治疗,常用剂量为50-100mg/d,而低于5mg/d的剂量,称为低剂量纳曲酮（low dose naltrexone,LDN）。研究发现,当应用LDN时,可以缓解免疫相关性疾病如多发性硬化、炎症性肌纤维痛、克罗恩病等的症状,并且在多种肿瘤细胞系中抑制其生长。LDN与化疗药物联合应用可以减轻化疗副反应,增强化疗疗效。虽然LDN在免疫治疗和抗肿瘤治疗方面报道存在一定的疗效,但其中的作用机制仍在不断研究中。LDN是否可以对结直肠癌也有抑制作用,其作用机制是怎样的,有待于进一步探索。巨噬细胞这一固有免疫细胞在免疫防御和肿瘤微环境中扮演了重要的角色。肿瘤相关巨噬细胞来源于单核细胞,通过细胞趋化因子2（CCL2）聚集到肿瘤附近,受肿瘤微环境的影响,经历着逐渐发展为成熟巨噬细胞的过程。按照活化状态和细胞功能主要分为M1型巨噬细胞（经典激活巨噬细胞）和M2型巨噬细胞（替代活化巨噬细胞）。巨噬细胞在脂多糖、IFN-γ、TNF-α的诱导下,形成M1型巨噬细胞,分泌IL-1、TNF-α、IL-6、IL-12等可以抑制肿瘤生长;在IL-4、IL-10、TGF-β的作用下,形成M2型巨噬细胞,分泌TGF-β、EGF、VEGF反而促进肿瘤生长。调节巨噬细胞和细胞因子有可能影响肿瘤的发生发展。本实验拟对LDN体内外抑制结直肠癌的作用机制进行进一步探讨,从以下三个方面进行研究:1.LDN是否可以抑制结直肠癌的增殖、影响细胞周期、促进凋亡,以及最佳的作用浓度和作用剂量。2.体内研究LDN对结直肠癌裸鼠皮下移植瘤增殖的抑制作用,以及对肿瘤恶性程度的影响,分析LDN对巨噬细胞不同类型及相关细胞因子的影响。3.信号通路的深入研究,LDN是通过什么信号通路而产生抑制肿瘤的效果。通过体内外的实验进一步明确LDN对结直肠肿瘤的抑制作用,为药物的临床使用奠定理论基础。研究方法:1、体外,采用CCK-8试剂盒检测不同浓度的LDN作用结肠癌细胞系（SW480、HCT116）和正常结肠粘膜细胞系NCM460,查看肿瘤细胞的抑制率,明确LDN是否特异性的抑制肿瘤细胞。用qRT-PCR法及Western blot法检测结肠癌细胞系（SW480、HCT116）中是否有OGFr的表达以及表达量的多少。体外,用不同浓度的LDN（0、0.25、0.5、1、1.5、2mg/ml）分别作用于人结肠癌细胞系SW480和HCT116,在24h、48h、72h的时间点上检测作用效果;寻找最佳浓度和作用时间进行后续的结肠癌细胞功能学实验。光学倒置显微镜观察结肠癌细胞的形态改变;通过克隆形成实验进一步检测结肠癌SW480和HCT116细胞系的增殖能力变化;采用Hoechst 33258染色法观察SW480和HCT116细胞是否发生了凋亡;流式细胞术检测结肠癌SW480和HCT116细胞是否发生凋亡及凋亡时期。2、构建结肠癌裸鼠皮下移植瘤模型进行体内实验。裸鼠头颈部皮下接种SW480细胞待成瘤后,将裸鼠随机分成两组:LDN给药组（5mg/2d）和阴性对照组（NS）,观察裸鼠一般状态,监测裸鼠体重和皮下瘤体积。19天后颈椎脱臼处死裸鼠,剥离皮下肿瘤称重。制备肿瘤石蜡切片,进行以下检测:HE染色检测组织病理形态,免疫组化检测肿瘤OGFr和Ki67的表达以及瘤组织中肿瘤相关巨噬细胞（TAMs）表面标志CD68、CD80、CD163的表达水平。免疫组化检测细胞因子TNF-α、IL-10的表达水平。3、信号通路研究:1mg/ml浓度的LDN作用48h,收集对照组和给药组的两种结肠癌细胞,提取mRNA和蛋白,RT-PCR法检测Bax、BCL-2、Caspase-8、Caspase-9、Caspase-3、Survivin的mRNA表达,Western blot法检测Bax、BCL-2、Caspase-8、Caspase-9、Caspase-3以及PARP的蛋白表达改变。结果:1、体外,LDN可显著抑制SW480和HCT116结肠癌细胞的增殖,并且存在着时间和浓度的依赖性,而对人正常结肠粘膜上皮细胞NCM460无明显抑制作用。LDN的作用下SW480和HCT116细胞中OGFr的表达量增加。体外实验中LDN最佳浓度为1mg/ml,最佳时间为48h。LDN作用下,SW480和HCT116的细胞体积减小,细胞数量减少,但细胞膜完整。凋亡相关实验证实,LDN诱导结肠癌细胞发生凋亡。LDN下调了Ki67的表达,降低了肿瘤恶性程度。2、LDN可以抑制人结肠癌SW480裸鼠皮下移植瘤的生长。在经过LDN治疗后裸鼠皮下移植瘤体积明显减小,瘤重明显减轻,而裸鼠体重则无明显变化。病理组织学检测发现,LDN治疗组肿瘤中央区域出现大面积坏死以及凋亡,可见核固缩深染,而对照组肿瘤组织中细胞紧密排列,形态整齐,有少量肿瘤细胞坏死。体内实验说明LDN可以通过诱导肿瘤细胞凋亡来延缓肿瘤的生长。免疫组化检测结果显示,裸鼠移植瘤组织中有OGFr的表达,并且LDN可以上调OGFr表达水平以及下调Ki67的表达水平,结果与体外实验一致。LDN通过诱导肿瘤相关巨噬细胞（TAMs）增加M1型巨噬细胞的数量,从而发挥抑制结肠癌的作用。在免疫组化定量分析中发现,与对照组相比,LDN治疗组CD68标记的TAMs增多,CD80标记的M1型巨噬细胞的数量显著增加,CD163标记的M2型巨噬细胞差别不大。相关细胞因子方面,M1型分泌的TNF-α的表达增加,M2型分泌的IL-10的表达减少。因此考虑LDN治疗后,以M1型巨噬细胞增加为主,促进了TAMs的抗肿瘤活性。3、LDN组可上调SW480和HCT116细胞中促凋亡相关基因及蛋白Bax、Caspase-9、Caspase-3的表达,下调抗凋亡的Bcl-2的基因和蛋白的表达。LDN可以下调PARP的蛋白表达,显著降低Survivin的mRNA水平。而对Caspase-8的m RNA和蛋白表达影响不大。结论:1、体内外实验均证实,在合适的剂量下LDN具有抑制结直肠癌增殖的作用。2、LDN可以诱导结直肠癌细胞凋亡。3、LDN可以上调OGFr的表达水平,下调Ki67,降低肿瘤的恶性程度。4、体内实验提示LDN可能通过增加M1型巨噬细胞的活性,增强TAMs的抗肿瘤作用,产生抑制肿瘤的效果。5、LDN调节肿瘤细胞微环境,促进TNF-α分泌,抑制IL-10的分泌。6、LDN可以通过调控Bax/Bcl-2/caspase-9/caspase-3/PARP信号通路诱导凋亡发生,发挥抑制结直肠癌的作用。