论文部分内容阅读
目的：本研究采用基因重组技术，拟构建猪囊尾蚴cYI基因的原核表达载体，观察其在大肠杆菌中的表达情况及其抗原特异性，为进一步研究cYI基因的蛋白质结构和功能，从而为开发囊虫病特异性诊断抗原和基因疫苗提供理论依据。方法：1.目的基因的获得：以本室克隆的保存在质粒内的cDNA为模板，根据已知cDNA序列设计引物，进行PCR扩增，同时设立对照组，条件为：94℃预变性5 min，94℃变性1 min，56℃退火1min，72℃延伸1 min, 30个循环结束，72℃延伸10 min。2.重组转化感受态DH5(：PCR扩增产物经低熔点琼脂糖凝胶回收纯化，经EcoR I及HindⅢ末端修饰后与经相同酶消化、回收的原核高效表达载体PMAL-C2进行体外定向重组，连接产物转化感受态E.coli DH5(，同时设立对照组，在含氨苄青霉素、IPTG以及x-gal的LB固体培养基中培养，根据β-半乳糖甘酶的(互补原则筛选重组子，挑选白色菌落，按碱裂解法提取质粒后进行双酶切，鉴定是否含有插入片段。3.重组表达：将含有目的基因的重组菌于37(C活化后转种到LB（含Amp）液体培养基中。次日按1:100的比例转种到LB（含Amp）液体培养基中继续在37(C摇床培养至对数生长中期，即OD600=0.5-0.6时，加入终浓度为0.3mmol/L的IPTG ，37(C摇床继续培养4-6 h。分别于诱导前，诱导后1、2、3、4、5、6 h取菌液1ml，离<WP=4>心，收集菌体并用TE Buffer悬浮。4.表达产物的蛋白电泳 (SDS-PAGE)：将阴性对照产物及诱导前后的表达产物PMAL-C-cYI离心收集菌体，置混旋器上振荡重悬，然后超声破碎菌体，分别收集上清和沉淀，取少量收集到的上清及沉淀分别加入等体积的2(SDS凝胶加样缓冲液混匀后煮沸5min，冰浴2-3min。再进行10% 的聚丙烯酰胺凝胶电泳，并以蛋白质低分子量maker作为标准。电泳结束后用考马斯亮兰对凝胶进行染色和脱色。将脱色后的凝胶照相。5. Western blot分析：将诱导前后的重组体及诱导后的空载体表达产物经超声破碎，10% SDS-PAGE电泳分离后，电转移到硝酸纤维素膜上，通过丽春红染色，观察转膜是否成功，同时参照蛋白分子量标准，确定是否含有靶蛋白，将膜沿电泳条带方向剪成数条后用5%脱脂奶粉封闭，然后与一抗（稀释的囊虫病病人血清，正常人血清和阴道毛滴虫病人血清）4(C反应过夜，洗膜后再与二抗 (HRP-羊抗人IgG作为检测抗体) 37(C反应1h，最后用底物溶液4-氯-1-萘酚过氧化氢系统显色，观察显色结果 6.重组蛋白的大量获得：将含有PMAL-C-cYI的重组菌活化后，于37(C，经IPTG诱导表达5h，离心收集菌体，超声破碎后溶于适量TE中再经滤器过虑除菌、纯化，紫外分光光度计测OD260定量，-20℃保存备用。结果：根据已知cDNA序列设计引物，进行PCR扩增后酶切鉴定DNA片段的大小，紫外灯下可见一条约550bp的特异条带，与预期大小相吻合。将该片段与表达载体PMAL-C2分别经双酶切后体外重组转化大肠杆菌，经蓝白斑筛选后获得含重组质粒的阳性克隆菌。重组质粒经<WP=5>EcoRI/HindIII消化，插入的cYI片段可被消化切下，符合预期设计。将上述阳性质粒转化宿主菌进行诱导表达，表达产物经超声破碎，离心后分别收集上清和沉淀进行SDS-PAGE电泳，结果表明该融合蛋白主要以包涵体形式存在于细菌裂解物的沉淀中，同时设置空载体表达产物对照，并参照分子量标准，可以看出，未插入目的基因的PMAL-C2/DH5(只表达麦芽糖结合蛋白（MBP）, 分子量约为42KD，而插入目的基因的PMAL-C-cYI /DH5(表达麦芽糖结合蛋白MBP- cYI，分子量约为60KD，与预期大小相符。同时经凝胶图像系统分析，该蛋白表达量约占菌体蛋白总量的28%。再经Western-blot检测，结果目的片段与囊虫病病人血清在大约60KD的表达产物位置出现单一显色条带，而未经诱导的菌体、空载体蛋白以及以两阴性对照血清为一抗的反应，在相应位置均无反应条带出现，表明目的片段可与囊虫病病人血清特异性结合。结论：（1）本实验成功构建了cYI的原核表达重组质粒PMAL-C-cYI；（2）重组质粒PMAL-C-cYI在体外得到高效表达，其表达量约占蛋白总量的28%；（3）Western-blot实验表明，目的片段可与囊虫病病人血清产生特异性免疫反应。