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DNA作为一种生物体内的内源性分子,是遗传物质的载体决定着物种的性状,除此之外,在巧妙的设计下,通过对DNA的构建,还被广泛用于生化分析、医疗诊断等领域。DNA自组装技术就是由DNA分子之间借助于Watson-Crick等碱基互补配对的特性进行精准的杂交,由DNA单链形成DNA双链甚至三链结构,再由这些双链结构不断地扩增组合形成新的二维结构、三维结构。等温信号放大技术能够实现在等温反应条件下对DNA片段短时间内的快速扩增,与聚合酶链式反应(Polymerease Chain reaction,PCR)相比较,最大的优势在于不需要反复变温和较高的设备要求、操作简单。目前DNA自组装技术广泛在各类生物传感器中应用,而等温信号技术的加入,使生物传感器灵敏度进一步得到提高。因此这两种技术的相结合在临床检测和诊断、环境卫生以及食品安全检测中具有很好的应用前景。本论文主要借助于DNA自组装形成不同的结构,并在催化发夹自组装(CHA)、滚环扩增(RCA)、杂交链式反应(HCR)以及核酸内切酶放大等核酸等温放大技术下,设计了三种便捷高效的荧光生物传感器策略,并应用于DNA甲基转移酶(Dam MTase)的活性和MicroRNAs(mi RNAs)两种疾病标志物的超灵敏检测。研究论文的主要内容概括如下:第一部分,构建了一种基于催化发夹自组装(CHA)耦联内切酶辅助循环放大的新型荧光生物传感技术并将其在DNA甲基转移酶(Dam MTase)活性检测中进行了应用。在该策略中,当目标物存在的情况下,能够诱导发夹特定序列甲基化,甲基化后的发夹被内切酶DpnI特异性识别并切割,裂解释放出的短链引发CHA反应生成三通路结构,同时实现对短链的循环放大。另一个循环放大过程借助于核酸内切酶Endo IV,通过设计了一个AP位点嵌入双标记的信号探针,用于组装到三通路结构的三个末端。利用内切酶IV(Endo IV)催化裂解AP位点,促使信号探针因不能稳定杂交而释放下来,新的未切割地信号探针再与三通路相结合被进而被切割,因此产生强烈的荧光信号。该方法中所用的两种放大技术,其中CHA是一种在恒温下自主进行的无酶循环放大技术,提高了检测灵敏度、实现了简单快捷的循环放大。而引入的核酸内切酶的放大技术可以使体系中更多的信号探针与三通路相结合,很大程度上提高了放大效率、降低了背景信号。基于上述几个方面,实现了对Dam MTase活性的超灵敏检测,检测限(LOD)低至0.00024 U/μL。第二部分,本论文开发了一种DNA三螺旋分子开关介导的滚环扩增(RCA)的新型荧光生物传感技术并在miRNA检测中进行应用,该策略中所设计的DNA三螺旋分子开关(THMS)标有荧光团/猝灭剂的同时还被巧妙地设计上特定的切刻内切酶识别序列,目标物的互补序列以及RCA产物的互补序列。从目标物附着在THMS上开始,诱导THMS构象的转换,同时发生“延伸-切割”的酶切放大过程,诱导产生多个引物继续触发指数RCA反应。此外,所得的第一轮的RCA产物包含可与THMS杂交的许多串联重复序列,能够与大量的THMS杂交,释放出大量的引物并启动第二轮RCA的进行。该方案在DNA自组装下形成THMS并与RCA等温放大技术的结合,使得该荧光生物传感器能够以高灵敏度检测miRNAs,改进的LOD低至1.1 aM,并实现在实际样品中的检测。第三部分,构建了一种基于G-四联体DNAzymes调控AuNPs/DNA-AgNCs荧光共振能量转移的新型荧光生物传感技术并应用于miRNA的检测。该生物传感器主要巧妙的设计使用了DNA-AgNCs链和具有荧光猝灭能力的AuNPs,以及G-四联体DNAzymes相结合,借助于杂交链式反应(HCR)实现了对miRNA-122无标记、无酶的超灵敏检测。当反应体系中没有目标物时,半胱氨酸可以通过羧合反应促使AuNPs的团聚;存在目标物时,可引发HCR反应,在加入血红素后通过DNA自组装形成大量的G-四联体DNAzymes,G-四联体DNAzymes可将半胱氨酸氧化为胱氨酸,胱氨酸无法对AuNPs进行团聚,因此实现了AuNPs吸附DNA-AgNCs单链,导致荧光猝灭,通过荧光检测实现对目标物的超灵敏检测。在最优的反应条件下,该荧光生物传感器能够以高灵敏度检测miRNAs。最低检测限为9 aM。改变靶标识别序列,该方案还可以用于不同目标物的检测。