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目的:
子宫内膜癌是妇科常见的恶性肿瘤之一，发病率逐年升高，在部分西方国家已成为最常见的女性生殖道肿瘤。目前，子宫内膜癌以手术治疗为主，放化疗及激素治疗为辅。子宫内膜癌根据临床及病理特征可分为Ⅰ型和Ⅱ型。Ⅱ型子宫内膜癌仅占20％-30％，多低分化，深肌层浸润、淋巴结转移和复发率高，预后较差[22]。miRNA是一种长度约22个寡核苷酸的非编码小RNA，通过与信使RNA（mRNA）3非翻译区(UTR)完全或不完全碱基互补配对结合，导致目的片段降解或阻碍其翻译过程，特异性调控mRNA的表达。miRNA几乎参与所有生物学过程，包括肿瘤的形成和发展。近年来，已成为肿瘤学领域的研究热点之一。miRNA通过对靶基因水平的调控，参与肿瘤细胞的增殖、凋亡、侵袭、血管形成和淋巴转移等过程。从而影响肿瘤发生、发展的各个阶段。目前，对于miRNA在子宫内膜癌尤其是Ⅱ型子宫内膜癌中的作用研究甚少，且Ⅱ型子宫内膜癌肿瘤进展程度高，预后差，单纯手术治疗效果较Ⅰ型子宫内膜癌差，寻求新的有效的治疗方法可能为Ⅱ型子宫内膜癌的治疗带来新的突破。通过之前的研究，我们发现正常子宫内膜与Ⅱ型子宫内膜癌组织中miR-449a的表达差异明显，本文将继续研究miR-449a在Ⅱ型子宫内膜癌细胞HEC-1-B中的功能和作用机制。为Ⅱ型子宫内膜癌的诊断和治疗提供新的理论参考。
方法:
1.microarray芯片及Real-time PCR: microarray芯片检测Ⅱ型子宫内膜癌组织与子宫肌瘤患者正常内膜组织的miRNA表达的差异情况，并用Real-timePCR验证芯片结果。
2.模拟剂转染:利用脂质体lipofectamine2000将模拟剂(miR-449a mimics)转入HEC-1-B细胞中。Real-time PCR证实转染后miR-449a的表达明显上调。
3.转染效率检测:将转染FAM-Transfection Control的细胞用流式细胞仪检测。
4.CCK-8检测细胞增殖:CCK-8检测转染miR-449a mimics后细胞增殖能力的改变。
5.流式细胞仪检测凋亡:转染miR-449a mimics后的细胞按照AnnexinV/PI试剂盒说明书染色后分析细胞凋亡情况。
6.平板克隆形成试验:将转染miR-449a mimics后的细胞连续培养10天，观察细胞克隆形成能力的改变。
7.Transwell迁移试验和细胞划痕试验:观察转染miR-449a mimics后的细胞迁移能力的改变。
8.Real-time PCR测靶基因的表达:转染miR-449a mimics48h后检测CDC25A基因的表达情况。
9.Western blot Analysis:检测转染后预测靶基因CDC25A蛋白水平的改变。
结果:
1.microarray芯片检测及Real-time PCR检测结果示miR-449a在Ⅱ型子宫内膜癌组织中较正常子宫内膜组织呈低表达。
2.流式细胞仪检测脂质体lipofectamine2000转染Ⅱ型子宫内膜癌细胞效率高，转染后24h转染效率约88.7％。
3.Real-time PCR示:实验组(miR-449a组)表达量较阴性对照组(NC组)和空白组（Mock组）明显增加(P＜0.01)。
4.转染后48h用CCK-8测吸光度示:miR-449a组为0.648±0.028，NC组为0.850±0.015，Mock组为0.834±0.016，差异有统计学意义(P＜0.01)。
5.转染后72h流式测细胞凋亡率示:miR-449a组凋亡率为5.137±0.156％;NC组为1.057±0.051％;Mock组为0.710±0.010％，差异有统计学意义(p＜0.01)。
6.平板克隆试验示:miR-449a组较NC组和Mock组克隆形成能力明显受抑。
7.Transwell和细胞划痕试验示:miR-449a组穿膜细胞数为:23.200±4.382;NC组为41.200±6.573; Mock组为75.200±9.628，差异明显(p＜0.01)。细胞划痕试验24h细胞迁移距离:miR-449a组(0.833±0.153)较NC组(1.400±0.200)和Mock组(1.500±0.100)差异显著(p＜0.01)。48h迁移距离:miR-449a组(1.633±0.115)较NC组(2.167±0.208)和Mock组(2.467±0.153)差异显著(p＜0.01)。
8.Real-time PCR测靶基因的表达:CDC25A在miR-449a组较NC组和Mock组下调(p＜0.05)。
9.Western blot分析:CDC25A蛋白在miR-449a组较NC组和Mock组表达水平低。
结论:
Ⅱ型子宫内膜癌较正常子宫内膜miR-449a呈低表达，上调Ⅱ型子宫内膜癌细胞HEC-1-B中miR-449a的表达，可抑制细胞增殖和迁移，促进其凋亡。表明miRNA在Ⅱ型子宫内膜癌中起类似抑癌基因的作用。初步认为miR-449a可通过抑制靶基因CDC25A表达抑制HEC-1-B细胞的生物学行为，可能为Ⅱ型子宫内膜癌分子靶向治疗的潜在靶点，为Ⅱ型子宫内膜癌的治疗带来新理论依据。