论文部分内容阅读
本研究以APPO为目的基因，通过农杆菌介导方法转化入‘澳洲青苹’苹果，采用RNAi技术，以期获得抗褐化的优良转基因苹果。通过研究影响农杆菌介导的‘澳洲青苹’苹果的遗传转化的因素，优化了‘澳洲青苹’苹果的遗传转化体系，建立了高效遗传转化体系，初步获得了携带DSAPPD为目的基因的苹果抗性苗。实验内容和研究结果如下：1．‘澳洲青苹’苹果无菌营养繁殖系的建立：研究了不同的消毒处理对外植体的影响及Vc、Ac、PVP、枝条遮光处理、低温暗处理对‘澳洲青苹’苹果初代培养中褐化的抑制效果。试验结果表明，70％酒精表面消毒30秒后用0.1％升汞浸泡消毒5分钟，再用无菌水冲洗5次，80％都没有污染。而对抑制褐变最佳的方案是幼芽用0.2％PVP浸泡后接种在含有Vc的培养基上低温暗培5-7天对褐变的抑制率可以达到最佳，‘澳洲青苹’苹果初代的成活率可以达到90％。2‘澳洲青苹’苹果再生体系的建立以‘澳洲青苹’苹果试管苗的叶片为外植体诱导不定芽再生，研究不同浓度的BA、TDZ、暗培养时间、叶片放置方式和AgNO3对叶片不定芽再生的影响。结果表明：最适宜的叶片不定芽再生的培养基为MS+TDZ2.0mg／L+NAA0.3mg／L+琼脂6g／L+蔗糖30g／L或MS+BA4.0mg／L+NAA0.2mg／L+琼脂6g／L+蔗糖30g／L，最适的暗培养时间是20d，不定芽的诱导率分别达到100％和91.7％。3．‘澳洲青苹’苹果遗传转化体系的建立以‘澳洲青苹’苹果的叶片为受体，确立了‘澳洲青苹’苹果的选择压，适宜的卡那霉素选择压10-25 mg／L．通过对影响遗传转化效率因子：共培养时间、培养基、抗生素种类、浓度、农杆菌浸染时间和卡那霉素选择压的优化，得出了较高转化效率的体系。浸染时间5 min，共培养时间3-4 d，卡那霉素选择压为12.5 mg／L。抗性愈伤率可以达到93.8％，抗性芽率可以达到14.1％。4．转基因苹果的检测通过GUS组织化学染色法，得到了4株GUS阳性植株，通过PCR检测间隔区YYT-1初步证明了目的基因已经整合到植物基因组。